在一个底物噬菌体展示实验的准备过程中，*步就是要确定用于文库展示的载体以及如何构建后继的底物文库。单价和多价的pⅢ蛋白噬菌体展示体系都可用于底物噬菌体展示。如果采用的是单价展示体系，只有一部分噬菌体颗粒的表面携带有单一的底物序列与亲和性结构域。这意味着在筛选之前，必须先通过亲和性结构域将噬菌体固定在一个固体支持物上。理论上，多价底物噬菌体展示颗粒都包含有超过一个拷贝的亲和性结构域和底物，要筛选出某一噬菌体颗粒时，蛋白酶必须对此噬菌体颗粒携带的多个底物都进行切割。假设所有的多价噬菌体衣壳蛋白上都同时表达有底物蛋白，那么筛选可以同后续的捕获亲和性结构域这一过程同时在溶液中进行。这使得实验具有可检测性；然而，有效的筛选要保证所有未剪切的噬菌体都能通过捕获与之共表达的亲和性结构域而去除。在实际操作中，一些携带有缺陷型表位的没有反应活性（即不能被剪切）的噬菌体克隆可能在此过程中被当作合适的底物筛选出来。同样的，一群给定的多价噬菌体中也可能包括有许多正在降解中的噬菌体，因此，单个病毒颗粒的效价可能有所变化。同时，多价的噬菌体展示体系也需要一个全长的、未剪切过的pⅢ蛋白来实现感染。如果经过剪切的噬菌体比未剪切的噬菌体有更高的感染活性，那么这一条件可以作为选择性的优势来筛选出酶的真正底物。然而，即使在没有蛋白酶切割的情况下，文库中的某些序列也可能具有较高的感染活性，因而使得初始的文库分布和随后的筛选过程带有偏差。
尽管存在以上的限制，单价和多价的噬菌体展示系统都已被成功地应用于确定许多蛋白酶的底物。在这一章中，我们将把注意力集中在pⅢ噬菌粒/单价展示系统，尽管这种单价展示系统中的许多特点和多价展示系统一致。底物噬菌粒展示中zui典型的一个载体，具有以下几个重要的特征：
①由亲和性结构域基因、编码底物序列和M13基因Ⅲ三个部分组成的融合蛋白基因；
②用于大肠杆菌中融合蛋白组成性表达的启动子序列；
③细菌及f1复制起始位点，加上一个抗生素抗性基因。
在第1章和第4章中可以找到更多关于噬菌体展示载体的细节描述。这里，我们将注意力集中于底物噬菌体展示应用相关的载体设计。
1 相互结合位点的选择
在蛋白酶底物噬菌体展示中，一个关键的组分是亲和性结构域，它使我们可以将底物序列和非底物序列区分开。这其中包括蛋白—蛋白相互作用、蛋白—肽段相互作用以及多*与镍螯合基质的结合。整合这几种不同的系统的要素在于，展示系统是基于高亲和性相互作用而设计的。通常，相互结合的两个物质之间的解离常数（Kd）应该至少在一个较低的nmol/L的数量级上，这样在实验中复合物的解离速度就可以比蛋白酶解的速度慢得多。例如，我们以往在这个领域中的工作中，利用的是一个hGH的高亲和性变异体，此变异体与其受体的Kd值约13pmol/L。然而，对于蛋白酶底物噬菌体展示库，挑选在适当的缓冲液条件下（例如低pH或高pH）能够被破坏的这种相互作用，将有助于选择性地富集非底物序列（被捕获而结合于固体支持物上）和*的底物序列（被蛋白酶解而释放）。另外一个必须考虑的是靶蛋白酶（或者其他的一些噬菌粒形成中可能碰到的蛋白酶）必须不会酶切亲和性结构域。由于这个原因，亲和性结构域一般都是一个稳定的球蛋白或者一个短的肽段。
2 底物卡匣（cassette）的设计和构建
底物噬菌体展示要成功，一个关键在于切割仅仅发生在亲和性（捕获）结构域和噬菌粒之间。幸运的是，丝状噬菌体对蛋白酶解有*的抗性：在所有已知的蛋白酶中，只有枯草杆菌蛋白酶能够引起噬菌体外膜蛋白的显著降解。为使底物序列更易与蛋白酶作用，在附近的连接序列中引入一定部分柔韧性（segmental flexibility）的设计要谨慎。例如，底物序列GPGG（X）。GGPG位于亲和性结构域和pⅢ基因之间，柔韧的*—*接头分布于随机序列的两端。在我们的实验中，已经证实截短形式的pⅢ蛋白是有效的，但另外也有报道使用全长pⅢ蛋白也能取得成功。在多价底物噬菌体展示中，一个全长pⅢ蛋白对于感染是必需的。
一些其他的重要因素也主导着文库卡匣的设计，包括随机化的密码子、密码子的选择以及文库的大小，这些在第2章中有详细的描述。在许多情况下，我们不可能穷尽含有8个或8个以上的残基的整个底物序列所有可能的排列。然而，在文库仅展示了一部分可得到的序列的情况下，我们也有可能得到关于底物特异性的相关信息。例如，要构建一个包含5个密码子的随机文库，可以先列举其中2个密码子的序列，以此作为参照序列；从中得到的信息可用于第二次的文库构建，即将此两个密码子固定，再列举另外3个密码子和（或）其他的扩展的底物序列。作为替代，可以通过整合已知的特异性决定因素并查明那些现在还较不清楚的因素，从头设计一个更集中的文库。
