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RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征
点击次数：822 发布时间：2010-11-25
反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。根据PRRSV的保守序列设计引物，如从病料中扩增出特异的DNA片段即可确定PRRSVRNA的存在，RT-PCR具有特异性好、敏感性高等优点，在疾病的诊断上得到了较为广泛的应用。Saurez等（1994）根据编码Lelystead病毒株（LV）ORF7的序列设计一对引物，建立了检测PRRSV核酸的RTPCR方法，结果从7株西班牙分离株中扩增到312bp的片段，通过测序，发现与LV对应的序列源性达96％一97％。检测试验感染PAM培养物的灵敏度zui高为6．7TCID50，而检测3周龄人工感染猪的临床样品zui高灵敏度为102TCID50。试验证明可以采用肺泡巨噬细胞、血清或血浆等样品通过RT-PCR进行PRRS早期诊断，样品如果先接种PAM进行培养，则可提高RT-PCR的检出率。Woensel等（1994）利用RT-PCR扩增PRRSVORF6中的245bp片段，结果可检测到组织培养物及精液中有PRRSV，并证明RT-PCR检测PRRSV的敏感度为PAM分离培养的10倍，尤其是在病毒活性降低或溶解不适应于细胞培养时更敏感。
Mardassi等（1994b）根据加拿大PRRSVlAF-expgl株的ORF7序列设计两对引物，1对引物是特异的，只能从IAFexp91RNA中扩增到预期的468bp片段，而不能从欧洲株（LV和Weybridge株）扩增到预期片段；另l对引物能从IAFexp91株与欧洲株中扩增到预期的片段，但片段大小有差异，欧洲株少35bp，电泳能与IAFexp91株扩增的片段区分开，可见，RT-PCR不仅可用于PRRSV的诊断，而且可以通过选择特异性引物，可区分PRRSV的不同毒株，这对PRRSV流行病学的研究十分有益。目前，RT-PCR是检测临床样品一种极为有用的工具，研究表明，RT-PCR比IFA更敏感，但与用PAM进行病毒分离敏感性相当，但当样品中没有感染性PRRSV存在时，病毒分离就显得无能为力了；根据PRRSVORFlb和ORF7的序列设计引物建立巢式PCR，检测精液中的PRRSV灵敏度达每毫升10个感染性病毒粒子，明显优于病毒分离（Christopher-Hennungs，etal，1995）。
核酸探针杂交和R~PCR检测技术，具有高度的特异性和高度的敏感性，引物和探针可大量合成并长期保存，检测速度快，结果可靠，同时还可避免散毒，尤其适合于没有PRRS国家的检疫工作，但因条件的限制，分子生物学诊断技术在基层检测单位的普及还有一段距离，目前在PRRSV的诊断应用仍然有限。