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技术文章
免疫电镜技术的染色方法
点击次数：482 发布时间：2010-12-18
疫电镜技术与光镜免疫细胞化学染色方法的基本原理和试剂准备基本相同，相关内容可参考本书第四章，这里仅介绍免疫电镜的几种染色方法，包括包埋前染色、包埋后染色和冰冻超薄切片免疫染色三种。
1．包埋前染色 包埋前染色即在进行常规电镜包埋处理前先行免疫组织化学染色，然后于解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修成2～4mm3大小的组织块，再按常规电镜方法处理，包括戊二醛的再固定、锇酸后固定、脱水、包埋、超薄切片和电镜观察等。如果特三性免疫反应的范围太小或只观察特定部位的免疫反应，为了准确定位，可做第二次包埋，引*次包埋时将已进行免疫反应的组织经戊二醛再固定、锇酸后固定、脱水及包埋剂浸透三置于两层耐高温的透明塑料薄膜之间（类似夹心面包），高温聚合后。在解剖显微镜下取出需要的阳性部位作第二次包埋，或将取出的阳性部位用强力快干胶粘在已聚合的包埋剂块上供切片观察。
包埋前染色的组织，以中间部位的结构较理想，表层因受机械修整、挤压的影响，超微结构保存往往不甚理想。为提高工作效率，进行超薄切片制作前，亦应先制作半薄切片观察。为避免超薄切片电子染色所用的铅或铀与免疫染色的结果混淆，应将相邻的超薄切片分别捞在两个铜网上，一张直接进行观察，另一张电子染色后观察，对比分析。
包埋前染色法的主要优点：①因组织细胞免疫染色前未经OsO4固定、脱水及树脂包埋等处理，故组织细胞的抗原性保存相对较好，可获得较好的免疫染色效果；②可在光镜下选取免疫反应阳性部位定位制作超薄切片，有利于提高电镜的工作效率。主要缺点是受到抗体穿透性的限制，组织深层细胞内抗原难以标记。
2．包埋后染色 包埋后染色即组织标本经OsO4固定、脱水、树脂包埋及超薄切片后再行免疫组织化学染色。值得注意的是，在包埋后染色标本制备时，OsO4固定可以省略或尽量缩短后固定时间，因为不少实验表明，OsO4可使组织细胞的抗原性明显减弱。包埋后染色是将超薄切片贴在载网上进行免疫染色，染色过程中应注意保持载网湿润，避免干燥。
包埋后染色具有超微结构保存好、方法简便、阳性结果可重复性好以及可信度高等优点，可对同一组织块的连续切片进行其他抗原的免疫标记，能更准确地解释免疫标记结果，而且还能在同一切片上进行双重或多重标记。该方法也具有明显的缺点，如抗原活性可因标本处理过程而减弱或消失。组织中的抗原可与包埋剂发生反应而改变性质，以及被包埋在包埋剂中的组织不易进行免疫反应等。据报道，应用无水乙醇或NaOH饱和溶液等处理超薄切片，可减少或除去组织细胞内的包埋剂，获得较好的染色效果。
3．冰冻超薄切片染色 将新鲜组织或轻度固定的组织置于2.3mol／L蔗糖液3～5小时，液氮速冻，利用冰冻超薄切片机在冰冻状态下制作超薄切片，厚度70～l00nm。冰冻超薄切片未经固定、脱水和包埋等处理而直接进行免疫染色，组织细胞的抗原性保存较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。但冰冻超薄切片制作难度大．要求技术熟练程度高，而且，需要特殊的仪器，难以普及推广。
环氧树脂包埋后免疫绞体金电镜回
箭头所示金颗粒沉积在胰*原颗粒部位