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技术文章
PCR-ELISA法诊断禽流
点击次数：494 发布时间：2011-1-4
PCR-ELISA是将一步RT-PCR技术与酶联免疫吸附法相结合，检测病毒的一项诊断技术。PCR的一对引物中，其中一个用*标记、另一个用地高辛标记，在酶标微孔板上用亲和素包被，PCR扩增后纯化片段加入微孔板中。此时，微孔板上包被的亲和素将与*标记引物上的*特异性结合而捕捉了PCR片段，然后在微IL板中加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，该抗体将与地高辛标记引物上的地高辛结合，从而形成亲和素-*-PCR片段-地高辛-地高辛抗体-辣根过氧化物酶复合物。加入酶的相应底物进行显色，便可判断PCR扩增的有无。由于该方法是PCR和ELISA技术的结合，所以它是一种两级放大系统、灵敏度更高。同时这种方法避免了PCR产物分析时，电泳的电极及染色过程，所以更为快捷、简便和灵敏。丹麦学者MMunch等建立的RT-PCR-ELISA方法，比常规RT-PCR敏感10～100倍，1个毒株（EID50＝10-84）的感染性尿囊液经10-7稀释仍能检出，与鸡胚病毒分离的敏感性一致。
国内亢文华等针对高致病性禽流感H5亚型病毒的包含多碱性氨基酸裂解位点特异性片断，设计用*和地高辛标记的特异性引物，从活禽*、肛拭子、粪便及病死禽组织病料中扩增标记RT-PCR产物，再以ELISA方法，用生物亲和素包被的微量板孔中杂交捕获RT-PCR产物·，再在微孔板中加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，该抗体将与另一引物上的地高辛结合，从而形成生物亲和素-*-PCR片段-地高辛-抗地高辛抗体-酶的复合物。加入酶的相应底物进行显色，便可判断PCR扩增的有无。由于该方法是PCR技术和ELISA技术的结合，所以它是一种两级放大系统，即PCR放大和ELISA放大，试验证实它的灵敏度已经超过鸡胚分离法（荧光PCR检出的zui低稀释度为10-6.67，鸡胚分离检出的zui低稀释度为10-7.67，PCR-ELtSA检出的zui低稀释度为10-8.8），证明本方法具有较高的敏感性，比普通PCR和荧光PCR更为快捷、简便、灵敏，同时这种方法避免了PCR产物分析时的电泳及染色过程。