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核酸杂交检测副溶血性弧菌
点击次数：1016 发布时间：2011-1-6
免疫学方法是在蛋白水平检测V．p，而核酸杂交则是在基因水平进行检测，，结果更为特异、准确、可靠。用于检测V．p的核酸杂交方法主要有斑点杂交、Southern杂交、夹心法杂交。
1）斑点杂交 1992年，Yamamoto等针对tdh和trh 101～125bp的基因设计探针，对V．p进行斑点杂交检测，其中
tdh探针基因序列为：5’-CCCCGGTTCTGAXGAGATATTGTT-3’，
trh探针基因序列为：5’-TCCAGGTTCGGAXGAGCTACTATT-3’，
其中X为dUTP，用于标记碱性磷酸酶。他们将V．p临床分离株的克隆基因片段点到尼龙膜，与探针在50~C杂交10min，洗涤，zui后底物显色。结果显示，tdh探针特异性为100％、灵敏度为93％；trh探针特异性为93％、灵敏度为86％。但是，tdh探针把部分弧菌科的其他细菌也检测出来，造成一定的假阳性，而且膜上核酸片段易脱落，不能长期保存。
2）Southern杂交 1998年，Suthienkul等对137株V．p临床分离株进行Southern杂交。tdh探针选自pKYl99的EcoRI片段，长359bp；trh探针选自pKY298的EcoRI片段，长334bp，两探针的dUTP都标记上地高辛。他们将菌株的DNA片段HindⅢ酶切、电泳、尼龙膜转移后，与tdh探针、trh探针杂交，然后与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体反应，zui后底物显色。结果显示，tdh探针和trh探针特异性好，把tdh’株（共127株）和trh+株（共37株）全部检测出来。然而，这种方法操作烦琐、时间长，不适合临床实验室的快速检测。
3）夹心法杂交 2003年，Lee等采用夹心杂交法检测海产品中V．p的基因。他们对微孔板进行NH修饰，然后与J／基因捕获探针的磷酸基团共价结合，接着把PCR变性产物、标记*的信号探针加到微孔板中进行杂交反应，洗涤后，与酶标链亲和素结合，zui后底物显色并在405nm紫外灯下检测。结果显示，该方法检测信噪比在14．1～43．2之间，特异性好，灵敏度高，能把每克牡蛎组织里10个V．p检测出来。该方法易于制成试剂盒，目前美国市场上已有销售。由于试剂盒已经把捕获探针固定在微孔板上，检测时只需把PCR产物加到微孔板中杂交就行了，操作简单，重复性好，灵敏度高，特异性好，能进行临床大规模的快速检测，并且易于在普通实验室推广。