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免疫印迹与免疫印迹的主要影响因素
点击次数：2403 发布时间：2011-1-8
免疫印迹是新近发展起来的一项技术。BurridgeK于1976年在其论文中发表的上图，是将SDS聚丙烯酰胺平板凝胶电泳的高分辨力和易操作性与电泳后抗原的定位分析相结合的*个例子。在此法中，将电泳后的凝胶浸入含有标记抗体的溶液内，然后洗去未结合的抗体，直接检测凝胶中的抗原。稍后的方法是使凝胶中的抗原扩散至经过处理的纸条上，通过共价结合将抗原固定。此法可在适当的纸面上呈现分离的蛋白条带。后来将蛋白以非共价方式结合于硝酸纤维素滤膜，它不是通过简单扩散而是以电洗脱方式转移至膜上。zui近将化学发光技术应用于抗原检测，极大地提高了免疫印迹的灵敏度，使其成为使用的免疫化学方法之一。
细胞糖蛋白转形后的改变：十二烷基磺酸钠凝胶中特异糖蛋白和抗原的鉴定
采用抗LETS蛋白的特异性抗体对十二烷基磺酸钠（SDs）凝胶直接“染色”以鉴定LETS蛋白条带。用7．5％SDS平板凝胶可同时分离若于份细胞样品。
免疫印迹为检测样品中是否存在蛋白抗原提供了一种可靠方法。该法鉴定蛋白质的原理是根据被测蛋白能与特异性抗体结合的特性和该蛋白的相对分子质量。免疫印迹亦可用于测定抗原的其他特性，如抗原的相对丰度或与其他已知抗原的关系。它也是评价新抗体特性的一种有用的方法。免疫印迹包括多个简单的步骤，可在一天内完成。该方法具有、简便、灵敏等特点。
免疫印迹可用于确定蛋白抗原的一些重要特性。如果人们想了解样品中是否存在某一抗原，以及该抗原的含量或该抗原多肽链的相对分子质量等有关实验问题时，均可采用免疫印迹技术。特别是对于那些不溶于去污剂裂解液的抗原，或者是难以标记、容易降解、不适于用免疫沉淀分析的抗原，均可采用免疫印迹进行分析。若是将免疫印迹和免疫沉淀结合使用，则能非常灵敏地检测次要抗原，并可分析各种抗原间特异的相互作用。免疫印迹还可用于确定蛋白质的*残基是否发生了磷酸化，以及测定抗原抽提物的质量。在评价不同来源抗体的存在、特异性和含量等特性时，免疫印迹尤其有用。此外，免疫印迹还可用于从多克隆抗血清中纯化少量的特异性抗体。因为抗原没有标记，仅仅是稳态水平的抗原可被测定，除非有特异性抗体，否则诸如蛋白质的生化特性，化学修饰，或半寿期等均不能用免疫印迹进行确定。
影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位性质。多数高分辨力凝胶电泳技术涉及抗原样品的变性，只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合。多数多克隆抗血清中或多或少地含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。相反，许多单克隆抗体不能与变性抗原反应，因为它识别的表位依赖于抗原蛋白正确折叠所形成的三维空间构象。
第二个影响免疫印迹实施的因素是蛋白质原液中抗原的浓度。对于中等分子质量的蛋白质（如约50kDa）其浓度需达到1／106左右时，才易于检出。采用目前的技术，浓变低至0．1ng的蛋白亦可被检出。稀有蛋白在进行凝胶电泳之前要进行部分纯化，我们认为免疫沉淀是制备样品、扩大免疫印迹检测范围的一种简易方法。
免疫印迹不需要高亲和力抗体。例如，某些在溶液中和抗原结合能力较弱的抗体，用于免疫印迹可获得满意效果，这是由于膜上局部抗原浓度较高。局部高浓度的抗原提供了较多的与抗体结合的机会，因此大大提高了相互作用的亲合力。抗原密度也有利于将低亲和力的抗体保留在膜上。由于反应的频率增强，脱离膜的抗体可与邻近的抗原位点重新结合。