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免疫沉淀操作步骤
点击次数：360 发布时间：2011-1-8
．主要内容
确定抗原的存在、质量、大小、转换、修饰及相关性。
多个步骤共需1／2—1天。
半定量到定量。
敏感性取决于抗原的相对质量及抗体的亲和力。
需要高亲和力的抗体。
2．操作步骤
（1）每1．0ml抗原溶液中加入50pl正常兔血清。
（2）冰上孵育1h。
（3）在孵育的同时，另将SAC在裂解缓冲液中清洗1次。每50u1正常兔血清使用100,ul包装好的SAC。以10 000g，30s离心SAC，用巴斯德移液管研磨使SAC再悬浮。10000g再次离心，移去洗液，将洗好的SAC微球置于冰上。
（4）孵育1 h后，用裂解产物再悬浮SAC微球。
（5）冰上孵育30min。
（6）4C，10000g，离心15rain，移去上清液储存。
（7）将上清分装入数个1．5 m1的管中。在不同的管中加入免疫血清或对照血清（杂交瘤细胞培养上清或小鼠腹水）。其他体积要与抗体量、抗原量的特殊处理相适应。
（8）冰上孵育1min。
（9）针对抗体—抗原反应，加入蛋白A还是蛋白G微球取决于所使用的抗体类型（见下表），加入100ml含有10％微球的裂解缓冲液（zui后微球体积为10 m1），密封，4C摇床孵育1h。
（10）10000g，15s，413，离心收集微球，用裂解缓冲液清洗免疫复合物3次，用23号针吸取裂解物和洗液。
（11）尽可能移去zui后的洗液。
（12）将免疫复合物进行分析，通常采用SDS-PAGE电泳。