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含氨基或可还原的硝基的小分子蛋白的交联
点击次数：790 发布时间：2011-1-8
含氨基的小分子可分为芳香胺和脂肪胺两大类。硝基也能还原成氨基。含芳香胺的小分子可通过缓慢加入硝酸，而使其转变为重氮盐，在pH约为9．0时，与蛋白发生结合反应。含脂肪胺的小分子可通过各种用于蛋白间耦联的方法如CDI，TDIC及马来酰胺化合物或NaIO4方法而结合于蛋白上。另一个方法是通过与对硝基苯氯（p-nitrobenzoylchloride）反应和其后丕原为对氨基苯亚胺（p-aminobenzoylamide）而将脂肪胺转变成芳香胺，在按上述重氮化后，这些胺即可结合于蛋白上。此外，双功能亚胺酯可与氨基形成脒，因此，可通过dimethyladip—midate将desmethylnortriptyline结合于p—半乳糖苷酶。下面举例说明。
1．小分子的重氮化及与蛋白的耦联
目的：耦联蛋白与含芳香胺的小分子。
操作步骤：
（1）溶解4 mmol／L小分子于100 ml 0．1mol／L HCl中；
（2）4~C搅拌中逐滴加入1％NAN02（应避免NaNO~过量太多，可用碘化物—淀粉试纸或用％淀粉和50mmol／LKI在一白色瓷反应盘上检查，游离硝酸使碘化物氧化成碘；碘与淀粉乏应显蓝黑色）；
（3）在持续加入NaNO。后15 rain后应出现游离硝酸；
（4）溶解蛋白于200mmol／L硼酸或碳酸盐缓冲液（pH 9．0）中；
（5）缓慢地加入重氮化小分子，同时轻轻振摇，以防止酸的局部过量，监测pH，当pH降至7．0时，则重新将其调至9．5；
（6）冰浴中混合2h，检查并调pH至9．0；
（7）用PBS透析2d，变换透析液数次；
（8）以20mg／ml贮存于一20~C。
2．双功能亚胺酯的应用
目的：耦联desmethylnortriptyline于6—半乳糖苷酶。
操作步骤：
（1）室温下溶解570pg desmethylnortriptyline和488ftg dimethyladipimidate于o．4ml含
5％（y／y）N—乙酰吗啉（N-ethylmorpholine）的无水甲醇中：
（2）30rain后，在溶于含10mmol／LMgCl：和lOmmol／L 2—巯基乙醇的100 mmol／L碳酸盐缓冲液（pH 9．9）的100~gp—半乳糖苷酶中加入0．1 ml酯； ，
（3）20~C反应90mln，加入1 ml含100mmol／LNaCl，10mmol／LMgCl2和lOmmol／L 2—巯基乙醇的50mmol／LTris-醋酸缓冲液（pH7．5）终止反应；
（4）透析或过SephadexG-25去除游离小分子；约有75％的酶结合了小分子。（如使用nortryptyline而不是desmethylnortriptyline，则仅约结合15％）。