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技术文章
大规模连接及纯化连接后的DNA
点击次数：410 发布时间：2011-1-25
[器材和试剂]
通用设备及试剂，以及以下的设备和试剂：
●T4 DNA连接缓冲液和10×T4 DNA连接缓冲液（New England Biolabs）
●DNA扩增仪充当16℃和70℃的孵育机
●使Tris缓冲液（USB）平衡至pH≥8．0的*
●24/1（体积比）氯仿/异戊醇
●70％的乙醇
●异丙醇
●5mol/LNaCl04（未调pH）
●U1trafee—MC 30000 NMWL纤维素微过滤装置（Millipore）
●噬菌粒载体（pG6A、pG6B、pG6C）及SfiⅠ和NotI消化得到的cDNA片段
[方法]
1．建立以下连接反应：
●载体DNA（pG6A ppG6B，pG6C）（10ug） x ul
●cDNA片段（3～5ug） y ul
●10×连接缓冲液40ul
●T4DNA连接酶（6WeissU/ul）5ul
●水400ul
2．在16℃过夜孵育。
3．在70℃孵育30分钟，使T4 DNA连接酶变性。
4．加1体积的乙醇并振荡45秒，在14000g微离心机中离心10分钟，然后将上清液转移到另一新的微离心管中。
5．加1体积的24/1（体积比）氯仿/异戊醇并振荡45秒，在14000g微离心机中离心5分钟，然后将上清液转移到一个新的微离心管中。
6．重复第5步。
7，（a）加0，1体积的5mol/LNaClO4和1体积的异丙醇，振荡并在14000g、14℃微离心机中离心30分钟。小心地去除上清液，用250ul 70％的乙醇洗沉淀物（在每次洗完之后在14000g室温下离心5分钟）。快速干燥沉淀物然后在40～50ul的水中打散沉淀物，将DNA储存在一20℃下。
（b）另一方面，经微过滤和浓缩进行纯化：将上清液加到微过滤装置中，在3000g微离心机中旋转15～20分钟，除去洗出液。然后加350ul的水再在3000g旋转15～20分 钟。重复此步3次，除去微过滤装置中的上层部分，将余下的取出放置到另一新的微离心管中，振荡并在14000g旋转5秒，以恢复离心管底部的DNA（40—50ul），zui后将DNA储存在-20℃。