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表位成熟
点击次数：615 发布时间：2011-1-25
由于DNA在细菌中低效率转化，噬菌体文库的复杂度常限制在108以内。因此噬菌体文库只包含所有可能序列的很少部分。这也是为什么从随机肽文库中筛选的配体常常是低亲和性的。一个有效克服这种限制并识别出有改进特性配体的方法，是进行“表位成熟”。对从原始文库中选择的肽序列进行部分突变，以产生一个突变体群。用血清样本筛选这种次级文库可识别到比原始引导序列更佳的配体。
这里我们报道了一个位点定向突变实验方案。此实验方案可以从单个克隆或克隆群中产生出多样性。此过程的设计是在肽编码序列中引进突变，而后通过在两端随机增加氨基酸残基来增加同一靶序列的长度。
实验方案的*步中，用特异性引物扩增单个克隆或克隆群的肽编码序列。然后按已知条件，在扩增序列中引入突变 （易错PCR）。扩增产物再用限制性内切酶BarnHⅠ消化；用*捕获的方法，将肽编码区域3，端的*化载体序列除去。限制酶所产生的单链5’端延长片段用绿豆核酸酶处理去除，zui终产物与3’-NNK接头连接，其序列结构如下： （NNK）5随机序列，接着是一个包含BamHI酶切位点的标签序列。反义链3’端的NH2基团决定着连接反应时接头物的方向。
用bio．for和bio．3’-NNK作引物，连接产物在突变条件下进行特异性PCR扩增，可在 肽编码序列进一步引人多样性。扩增产物用限制性内切酶EcoRⅠ/BarnHⅠ消化，并用链霉 素捕获的方法将*化末端片段去除。zui后，所得到的产物被克隆到pC89载体的ecoR Ⅰ/BamHⅠ位点中间。
可采用类似策略在5’端添加随机残基，延长外源肽序列的长度。
表位亲和成熟实验方案示意图。灰色区域表示外源肽序列，而黑点代表原始序列的突变位点。箭头表示PCR引物；NH2指3’端氨基酸连接子。b表示*标记