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ELISA测定血浆中C
点击次数：614 发布时间：2011-1-25
C5活化是过敏毒素释放和膜攻击杀伤细胞机制的开始。C5活化后产生C和C5b两个片段，C被血清羧肽酶N裂解成无活性的C-desarg。C对中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞有趋化作用，并参与初次免疫应答，控制抗体合成和感染的发生及发展。因此检测C5裂解产物对临床监视病情发展有一定的意义。
1．原理 将抗C单克隆抗体包被固相聚苯乙烯板，加入经聚乙二醇（PEG）处理的待测样本，然后依次加入兔抗人C-IgC多克隆抗体和过氧化物酶标记的猪抗兔IsC，再加入底物2，2’—连氮—双（3—乙基苯骈唑啉-6-磺酸盐）（ABTS）和H202显色，于酶标仪405mn处测定每分钟光密度增加量（0D/rain），以OD/rain为纵坐标，C标准晶浓度为横坐标绘制标准曲线图，求出待测样本中C的含量。
2．主要试剂
（1）PBSPH7．2，9mmol/L磷酸盐缓冲液（PB）含140mmol/L NaCl。
（2）PBS-Tween pH7．2PBS含0．05％Tween20，简称PBS-T。
（3）底物溶液：100mL 2mmol/L ABTS溶液中含100mmol/L醋酸钠，50mmol/L磷酸钠，2．5mmol/L H202。
（4）沉淀剂：①：100mL pH8．0，20mmoL/L Tris-*-HCl缓冲液中含20g PEG 4 000，0.8g Rivanol；沉淀剂②：100mLp H2．0.100mmol／L*-HCl缓冲液中含20g PEG4000。
3．方法
（1）用盐和/或PEG沉淀血浆中C5：在微量反应板中加入EDTA抗凝血浆100gL，然后加人100/uL沉淀剂，用下述三种方法中任何一种沉淀血浆中C5。
1）在微量反应板中加入100uL 2mol/L HCl与100uL EDTA抗凝血浆混合，室温5h.加入HCl后血浆pH值在1．0—1．5之间。上清用4倍体积的0．29mol/L Tris调节至pH7．1-7．4。
2）在微量反应板中加入100uL沉淀剂①，室温30rain。
3）在微量反应板中加入100uL沉淀剂②（血浆pH值在4．0—4．5之间）。室温30rain。 用方法2）和方法3）沉淀C5后，上清加入4倍体积的含0．05％Tween 20 pH7，10．21mol/L Tris-HCl缓冲液，血浆被稀释10倍。
（2）用抗C单克隆抗体（McAb）包被酶标反应板：用pHl0．6，50mmol/L碳酸钠溶液将抗CMcAb稀释成10ug/mL，每孔加100uL，4℃ 16h。次日取出每孔加含1％（W/V）明胶的PBSl50gL，室温lmin；然后用PBS-Tween 20洗涤一次。
（3）样本中CSa的检测：洗涤后的酶标板，每孔加入方法1）、2）或3）处理的血浆样本zoot&，4℃16h,用PBS-Tween20洗涤1次，每孔加入用含0．1％明胶的PBS-T稀释的兔抗人CSa-IgC．多克隆抗体（46ug/mL）100t&,室温2h，用PBS-Tween20洗涤3次；每孔加入用含0．1％明胶PBS-T稀释的过氧化物酶标记的猪抗兔IgClOOt&（稀释前lmL过氧化物酶偶联物内加100ul无关鼠McAb、10ul人血浆或10ul激活的人血清处理），室温2min，每孔用PBS-Tween20洗涤4次；每孔加入底物溶液100ul，lmin后以PBS-T调零，每3min于酶标仪405nm处读取OD值。以OD/min增加量计算过氧化物酶活性。其活性与血浆中C含量呈正相关。本法zui低检测极限为1ng/mL，此法未检测出正常人新鲜血浆中的C。
（4）标准曲线的绘制：取已知浓度纯化的C，对倍稀释成一系列不同的浓度（0.039—5.000ng/mL），分别加入包被有抗CMcAb的酶标板中，然后按上述方法依次加入兔抗人C-IgC和过氧化物酶偶联的猪抗兔IgC及过氧化物酶的底物，以PBS-Tween调零点，读取OD40s/min增加量，以C（desarg）浓度为横坐标，OD40s/minx 200为纵坐标绘制标准曲线。每次绘制标准曲线应取6个已知浓度的纯化C。