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Real-time PCR应用于金葡菌检测
点击次数：628 发布时间：2011-5-31
实时定量PCR是近年来备受重视的PCR技术，其中荧光定量PCR（FQ-PCR）因可通过检测荧光强度的即时变化而直接检测样品基因拷贝数，无复杂的产物后处理过程，、快速，因此应用更为广泛。其基本原理是PCR进行一个循环，合成了多少新链，就水解了多少条探针，释放了相应数目的荧光基团，如果测定每一次PCR循环结束时的荧光信号，与标准品曲线对比便可确定zui初模板DNA数量。
常规PCR是通过检测zui终扩增结果而判断是否有足够量靶基因的存在，其判断标准易受样品处理过程、DNA提取操作、PCR反应体系等多种因素影响；而Real-timePCR由于其操作系统封闭、自动化程度高，因此可以更有效地即时检测出目标基因拷贝数，假阳性率低，近年来发表了大量相关的研究报告，而且通常是将其与多重PCR结合在一起以求更率。
A．M．Costa等人以meca及nuc基因为目标基因，进行了多重-实时PCR并与传统的PCR-电泳检测相比较，可在2h内非常准确地检测出金葡菌及耐*金葡菌，有很好的应用价值；IngeborgHein等用两种方法针对NUC基因进行了Real-timePCR检测，发现TaqMan探针[6拷贝s～L（以nuc基因计）]比SYBRGreen工探针有更高的检测灵敏性[60拷贝～L（以nuc基因计）l并进一步研究了干酪中污染金葡菌的检测情况，发现该方法可检测到（1.5X102）～（6．4X102）拷贝／2g（以nuc基因计），且nuc基因拷贝数与S．aureus菌数有很好的对应性（0．979-0．998），因此该RT-PCR技术可有效地检测金葡菌。国内目前已经有针对金葡菌检测的成品RT-PCR试剂盒，如缮钲诔鋈司臣煅榧煲呔趾蜕钲谔蚬こ逃邢薰玖涎蟹⒌摹笆吃葱灾虏【凳庇釶CR检测试剂”，具有灵敏度高、特异性强、使用简便等特点，为致病菌的快速准确鉴定提供了相应的技术保障。
张红河、张卫英等选择femB、sea和sed基因分别作为*菌株、肠毒素A、肠毒素D的靶序列，设计合成引物和探针；收集食物中毒导致腹泻的患者粪便标本487份，并对其进行检测分析。结果表明采用荧光聚合酶链反应检测*和肠毒素A的灵敏度为110X102拷贝，而检测肠毒素D的灵敏度为110X103拷贝；487份粪便标本中检出*72例（14．8％），检出产肠毒素A菌株为11例（15．3％，11／?2），产肠毒素D菌株为9例（12．5％，9／72），同时产肠毒素A、肠毒素D菌株1例（114％，1／72）。此研究说明应用Taqman探针实时荧光PCR技术能够快速、准确检测*及其肠毒素，适合于大样本筛查。
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