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多重PCR应用于金葡菌检测
点击次数：454 发布时间：2011-5-31
一般的PCR仅用一对弓I物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，而在多重PCR中（又称多重引物PCR或复合PCR），在同一反应体系中含有两对或两对以上引物，同时扩增多个核酸片段，其主要特点如下。a．性：在同一PCR反应体系中可同时检测出多种目标DNA。b.系统性：很适合对症状相同或基本相同的一组病原菌进行检测。已经济简便性：可大大节省时间和试剂，节约开支。鉴于多重PCR技术的诸多优点，研究者针对金葡菌上述各种目标基因，做了各种不同组合的多重PCR试验，以求在同一反应体系中同时检测多种目的基因，取得了较好的结果。
NARESHK．SHARMA，等建立了一种多重PCR检测肠毒素A～E，利用了几种毒素基因的通用保守序列及特异序列，即一个相同的上游引物及特异性下游引物，可在3-4h内检测出毒素基因A-E，且与标准的免疫检测有近99％的对应性；利用16SRNA和23SRNA间的间隔序列DNA作为模板，由于其被认为是非功能性片段，因此其变异性比16SDNA高10倍，可以有效地区分种间差异，P．Phuektes等利用该序列进行的多重PCR可以同时鉴别四种乳房炎病菌：S．aureus、S．agalactiae、S．dysgalactiae和S．uberis。更有甚者，通过两个PCR反应体系、两对引物同时检测了包括肠毒素SE、TSST4、Ets、meca在内的10种毒素的基因，且效果很好，有很好的应用前景。
吴永生、刘思国、何浩等根据*（Staphylococcus aureus，SA）耐热核酸酶（nuc）基因、伤寒沙门菌（Salmonellatyphi，ST）鞭毛抗原（HI-d）基因和副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus，VP）热稳定直接溶血素（tdh）基因，分别设计了三对引物Nue-F／Nu-R、H1-d-F／HI-d-R和Tdh-F／Tdh-R，预计PCR扩增的DNA片段分别为279bp、202bp和458bp。通过对单个基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及对单管多重PCR扩增条件（如引物浓度、退火温度和dNTP浓度等）的优化，建立了快速检测*、伤寒沙门菌和副溶血弧菌的单管多重PCR方法，该方法检测的敏感性分别为：47．8pgST的基因组DNA，22．7pgSA的基因组DNA和0．3745pgVP的基因组DNA。模拟试验显示zui低检测限度为分别为：SAl50CFU／反应体系，ST98CFU／反应体系，VP53CFU／反应体系。表明该方法具有很好的应用价值和开发前景。