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上海酶联生物研究所
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阅读：518发布时间：2011-10-14
1.挑取适当菌株的E.coli 单菌落接种于2ml SOB培养液中，37℃摇床过夜。
2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50ml SOB中，18℃剧烈震荡，直到A600达到0.6。
3.将培养物转移到50ml离心管中，4℃ 4,000rpm/min离心10min。同时在冰浴上配置TB溶液。
4.弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。
5.取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀，再加入15ml TB（1/3体积的起始培养液），冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min离心10min。
6.弃上清，沉淀重悬于4ml TB（1/12.5体积的起始培养液），冰浴10min。
7.加入280μl DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴10min。
8.将菌液分装于EP管中，-80℃或液氮冻存。
9. 取两管感受态细胞分别加入1μl无菌ddH2O（阴性对照）和1μl纯质粒（阳性对照）进行转化（见后），以检测感受态的质量。阴性对照平板上应该无菌落生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。
SOB的配制：
蛋白胨 20g
酵母提取物 5g
NaCl 0.58g
KCl 0.186g
100×Mg++溶液 10ml
溶解并加水定容至1L，121℃×20min高压蒸汽灭菌
100×Mg++溶液：
MgCl2﹒6H2O
MgSO4﹒7H2O
溶解并加水定容至100ml，121℃×20min高压蒸汽灭菌
TB溶液的配制：
1M KCl 5ml
0.55M MnCl2 2ml
0.5M CaCl2 0.6ml
0.1M K-Pipes（pH 6.7） 2ml
ddH2O 10.4ml
Total 20ml
注：上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理
0.1M K-Pipes（pH=6.7）的配制：
称取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O中，此时粉末不能*溶解，用10N KOH或KOH固体调节PH值，只有当PH接近6.7时粉末才能*溶解，此时当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值。
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