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上海酶联生物研究所
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阅读：1313发布时间：2012-8-22
观测RNA可为研究人员带来许多新的认识。存在于特殊细胞以及这些细胞特殊位点中的RNA可以揭示潜藏在差别背后的机制。在癌症和其他疾病中，RNA转录物有时会被发现存在于错误的地方。“这就是为什么大家会对RNA的定位感兴趣的原因，然而RNA成像一直是一个挑战，”威尔康乃尔医学院从事RNA调控研究的Samie Jaffrey说。
在过去的12个月里，RNA显像能力解答了关于流感病毒如果包装其基因这一长达半世纪之久的争辩，帮助揭示了H1N1 RNA是如何深入穿透肺组织的，揭露了令人惊讶的剪接动态，证实了RNA转录物上的启动子调节了转录物的稳定性，证明了神经元mRNA借助单个的颗粒运输到了树突中。Jaffrey说成像对于其他方式很难研究的调控性RNAs尤其重要，“了解非编码RNA的定位有可能帮助我们了解它们的功能。”
生物化学、成像和标记的进步正在不断扩展研究人员能够在单个细胞中观测RNA的途径。可靠、方便的试剂现在可在市场上购买到，用于在各种情况下标记固定细胞中的RNA。在活细胞中研究RNA转录物的技术更具挑战性，但它们也在不断扩展和改良。
RNA FISH在固定细胞中发现单分子
原位杂交（FISH）是通过利用附着荧光染料或其他标记物的互补寡核苷酸组成的转录物特异性探针来揭示RNA。报道RNA荧光原位杂交是在上世纪80年代，其操作困难且应用有限。然而这一曾经了不起的艺术现在已经成为了一种方便的技术。
如果某些商家的希望被实现，在细胞内成像RNA转录物将成为像蛋白质免疫染色一样的常规的技术。临床诊断公司Advanced Cell Diagnostics的执行官Yuling Luo说在基于抗体的蛋白质标记存在问题的地方RNA标记有可能实现。他解释说因为有可能无法获得适合的抗体，蛋白质的结构或定位有可能阻碍标记或是标记一种蛋白的条件或许不适于标记另一种。相反，*不同蛋白质的RNA转录物都可以在相同的分析条件下进行检测。Luo和其他人希望将RNA转录物作为生物标记的应用将不断增多。
RNA成像也可以解答基因表达谱研究提出的一些问题。曾经科学家们追踪过一些转录物开展进一步的研究。RNA原位杂交可以显示基因如何在整个细胞群中表达，在同一个细胞中哪一对转录物一起增高和下降，一种转录物是否定位在特异的细胞类型中或是像树突这样的特殊区室内。原位杂交还可以证实RNA干扰研究中一种转录物是否确实受到了抑制。
麻省理工学院和Hubrecht 研究所系统生物学家Alexander van Oudenaarden 说RNA FISH研究的一个巨大推动力就是越来越多的人对细胞所包含的惊人的异质性感兴趣。“如果你忽视细胞的个体性，在一根试管中将它们混合到一起，你zui终获得的将是实际上不存在的平均个体。”他提供了一个可口的比喻：只是品尝沙没有人能够学会区分芒果、香蕉或草莓不同的口味。相邻的细胞可能刚好不同，检测它们需要分辨单细胞基因表达。
van Oudenaarden利用RNA FISH在小鼠肠冰冻切片上显示了作为三种类型干细胞标记的转录物在隐窝中的分布。肠隐窝常被用于研究再生和分化。利用原位RNA，可以快速挑选出大量的标记物，组合观测它们看看哪些*地识别了不同的细胞类型;用荧光蛋白标记完成同样的事情将是不太可能或不切实际的。van Oudenaarden.说：“无需遗传修饰任何东西，你就可能获得大量的进展。这相当的容易。我们开玩笑说我们甚至不是生物化学家。”他说难的是设计成像系统和相应的软件。
*个普遍应用的RNA FISH探针是利用质粒来生成反义RNA，其掺入的修饰核苷酸结合到了随后可以被标记的抗体上。阿尔伯特爱因斯坦医学院的Robert Singer实验室构建出了另一种方法，用酶将荧光核苷酸类似物掺入到长双链DNA分子。他们后来改良了这一技术利用几组更小的合成DNA探针，每种探针大约50个核苷酸长，标记着一些小分子荧光基团。
Tyagi说利用更短的、逐个衍生的探针在固定细胞中生成RNA标记更易于处理。“这是一个简单的步骤可以解决大问题。由于寡核苷酸合成已经变为自动化，你可以在96孔板中生成寡核苷酸。”他补充说更多更小的探针提供了其他的利益。例如，一种探针的结合松解了转录物使得其他的探针更易于结合。并且并不是每个探针都需要是的，“你得到的是所有或大多数探针结合的信号，非不是一个或两个错误结合的信号。”
Biosearch Technologies公司在去年9月推出了短的逐个标记的探针Slaris FISH。在研究人员在线输入他们需要的转录物的序列后，公司的软件会设计出数组多达48种探针来标记它。Biosearch提供8种荧光基团选择，从蓝色到红色，研究人员也可以购买为标记的衍生探针，自己添加荧光基团。例如，van Oudenaarden将特异的基团附着到了波谱的红色端，从而可以与蓝色的核及绿色标记的蛋白一并成像。Tyagi在同一套探针内利用两种不同的基团检测了RNA加工事件，例如选择性剪接形式。相似的方法可以鉴别融合基因。
这种方法被van Oudenaarden'的前博士后Arjun Raj进一步改良，他和新泽西医学与牙科大学的Sanjay Tyagi设计出了更短的用于RNA FISH的寡核苷酸。这一系统利用数组约50种左右的探针，每种靶向转录物不同的部分。这些探针大约20个核苷酸长，用单个荧光基团修饰，更易于穿透细胞，相比于长探针制造更便宜更快速。然而，这种策略不能靶向短于约800个核苷酸的转录物，因为较少标记的转录物很难看见。
Biosearch Technologies 公司企业发展部主任Marc Beal 说5纳摩尔的混合定制寡核苷酸的标准定价为575美元，足够进行500-2000次反应。Beal说该系统可以与各种荧光显微镜包括广野显微镜和共聚焦显微镜一起使用，可用于冰冻、石蜡包埋组织样品以及培养细胞。采用油浸透镜可将“RNA点”放大60-100倍。Biosearch也正在开发一种可自动分析的成像系统。
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