酶联免疫试剂盒的反应

1、仪器设备

酶联免疫检测仪（Bio－550）；酶标板 （96孔）；微量注射器。

2、试剂

 （1）HRP标记羊抗兔Ig G（1:1 000，国产）；标准牛IgG；兔抗牛血清（1:256）；

 （2）包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存, Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g,蒸馏水稀释至100 mL。 

（3）稀释液与洗涤液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃，保存。NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween—20，0.5mＬ。蒸馏水加至1000mＬ。

（4）封闭液：含0.1%明胶0.01mol/L PBS， pH7.4。

（5）邻苯二胺底物溶液（临用前配制）：临用前将Na2HPO4·12H2O 2.9g,柠檬酸0.51g溶于100mL蒸馏水中, 再加入40mgOPD，40μL30%H2O2。

（6）终止液：2mol/LH2SO4。于500mL蒸馏水中加入98%浓硫酸76mL混均即可。

3、操作方法

 （1）将抗原结合在酶标板上。取标准IgG（10mg/mL）用碳酸盐缓冲溶液稀释，得到浓度为0.1μg/mL的包被液，每孔加人100μL抗原包被液，并以不加标准抗原的两孔为对照，为反应的0%值，将反应板于4℃放置一夜（8个样品，分3个平行，4个100%值孔；共28+2孔）。

（2）标准牛IgG与初级抗体一兔抗牛血清的反应。将标准IgG（10mg/mL）用稀释液作二倍稀释得到一系列不同浓度的标准牛IgG（4μg/mL至0.325μg/mL）各200μL，加到入32倍稀释好的200μL的兔抗牛血清中，其中4个不加标准牛IgG作为测量时的100%值。4℃反应放置一夜。

（3）封闭板。将包被好的酶标板孔内液体倾去，进行洗涤，各孔加200μL洗涤液后室温下放置1min，倒掉，如此重复4次后，在吸水纸上拍干，加封闭液进行封闭，在37℃放置45min（注意：空白孔也要加封闭液）。封闭后，如前述洗涤。

（4）向酶标板中加人标准抗原和抗体的混合物。将标准牛IgG和兔抗牛血清的混合物取100μL加入到酶标板孔内，同是4个未加抗原的100%值的平行样也加入酶标板中。37℃放置2h，再洗板4次。

（5）加人HRP标记的羊抗兔Ig G。洗涤后每孔加100μL稀释好的HRP-羊抗兔IgG，37℃放置1h，洗涤。

（6）加人OPD底物。洗板4次后，每孔加人100μL底物溶液，于37℃暗处反应20min后，每孔加人50μL结束反应液以终止反应。

（7）吸收测定。用酶联免疫检测仪测定波长为492nm下的吸光值。

（8）数据处理。标准曲线是以Ig（标准牛IgG含量）对B/Bo作图，求得线性方程。其中，C为标准牛IgG含量；B为不同浓度标准牛IgG吸收值与0%吸收值之差;Bo为100吸收值与0%吸收值之差。