CAT#:D1600-50

 细 菌 DNAOUT /Bacterial DNAOUT使用说明书

产品及特点 ：本产品可以用于绝大多数革氏阳性和阴性细菌基因组 DNA 的快速提取。

1. DNA 纯净，OD260/280 一般都在 1.9 左右，可直接用于 PCR、酶切、杂交等实验。

2. DNA 产量一般在 5-20 ug/mL 饱和菌液（10⁸-10⁹个细胞）。

3. 操作简单，整个过程约 15 分钟，容易放量操作。

4. 每次提取可以处理 0.1-1.5 mL 的细菌，也可以使用菌落。

5. 安全无毒，本试剂盒对人体无害，无腐蚀性和刺激性气味。

规格及成分:   成 份           编 号      50次包装   250次包装

             *         100406      600 mg       3 g

              溶液 A        D1600-50A   30 mL       150 mL

              溶液 B        D1600-50B   7.5 mL       40 mL

   RNase A 溶液（10mg/mL）  3160        0.75 mL      4 mL

运输及保存:常温运输及保存（*需要-20℃保存）有效期一年。

自备试剂: 超纯水、氯仿和 TE 缓冲液。

使用方法: 注意：溶液 A 和溶液 B 容易产生沉淀，溶液 B 比较粘稠，用前均需要放置在 65℃预热使沉淀溶解、粘稠度降低，用前充分摇匀。

一: 对革氏阴性细菌样品

1. 将 0.1-1.5 mL 过夜培养的菌液转移到 1.5 mL 塑料离心管中， 12000-15000 g室温离心 1 分钟沉淀细菌，弃上清。

2. 加入 600 uL 预热的溶液 A 到细菌沉淀中，充分吹打均匀。

3. 再加入 150 uL 预热的溶液 B 到离心管中，颠倒数次混匀。此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生。由于溶液 B 比较粘稠，可以采取称量方法取用，150 uL 约等于 150-160 mg。也可以将 1 mL 枪头剪去一截再吸取。也可以同时加入 15 uL的 RNase A 溶液。

4. 65℃放置 3-5 分钟。如果室温放置，DNA 产量会降低 10-20%。

5. 加入 200 uL 自备氯仿，震荡混匀 10-30 秒，此时溶液将呈乳白色。

6. 12000-15000 g 室温离心 2 分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的 1.5 mL 塑料离心管中，避免触及中间层的白膜。

7. 加入 1 倍体积(约 750 uL)的异丙醇到上清液中，用手上下颠倒 30 秒混匀。此时一般将有絮状 DNA 沉淀出现。

8. 12000-15000 g 室温离心 3 分钟。此时管底将有微小 DNA 沉淀，小心弃上清，注意不要丟弃 DNA 沉淀。

9. 在离心管中加 1 mL 75%乙醇，短暂震荡，12000-15000 g 室温离心 3 分钟，弃上清。

10. 重复上述操作一次。

11. 短暂离心，小心吸弃残留的液体（约 50 µL）。此步不要省略，否则残留的液体（含

乙醇）将会影响 DNA 电泳、酶切很 PCR 等反应。

12. 立即加入 50-100 µL TE 缓冲液充分溶解 DNA 沉淀。注意：由于基因组 DNA 较长并在沉淀时形成紧密复合物，充分溶解的时间远长于质粒 DNA 或 PCR 片段，有时需要长达数小时。如果在第 3 步没有加 RNase A 溶液，或虽然加了但还担心有残留的 RNA 污染，可以在此时补加 5-10 uL 的 RNase A 溶液，保温 30 分钟。

13. 直接取 5-10 uL 电泳检测 DNA，其余放冰箱备用。

二: 对革氏阳性细菌样品

1. 将 0.1-1.5 mL 过夜培养的革氏阳性细菌 12000-15000 g 室温离心 1 分钟后, 重悬于 0.6 mL 溶菌液中（溶菌液配制:30 mL 超纯水+600 mg *，配制后分装成小管并放-20℃长期保存，每次只用一小管)，颠倒混匀 5-10 次后放 37℃保温至少 30 分钟(有的革氏阳性菌种可能需更长时间，需要自己根据不同的细菌摸索)。

2. 12000-15000 g 室温离心 10 分钟，小心弃上清。

3. 后续处理接上面的革氏阴性细菌提取步骤中的第 2 步。

三: 其他注意事项

1. 可以直接使用细菌菌落提取 DNA，操作时直接将细菌菌落挑入到溶液 A 中，后续操作同上。

2. 从单个菌落中提取到的 DNA 较少，所以只用 10-30 uL TE 溶解。

背景资料 

G+和 G-细菌细胞壁比较

细胞壁特性                      革氏阴性菌    革氏阳性菌

厚度                             10 nm         20-80 nm

细胞膜层数                        2              1

肽聚糖（Peptidoglycan）含量       10-20%          >50%

磷壁酸（Teichoic acid）             无              有  

脂及脂蛋白含量                   58%           0-3%

蛋白含量                          9%            0%

脂多糖（Lipopolysaccharide）含量    13%            0

对*敏感性                    低             高

对*（Lysozyme）敏感性        低             高