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上海永叶生物科技有限公司
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阅读:1917发布时间:2011-9-14
纯化过程在DNA全自动合成仪上是自动进行的,但也有以下几种手工方法可以选择。
1.NAP柱纯化
由Pharmacia公司生产,主要成分为SephadexG-25,经特殊处理后装成不同体积的小柱,常用的有NAP-10。含寡核苷酸片段的氨水溶液,调整体积为lml加样于NAP-10柱上(使用前以15ml双蒸水平衡柱子)以lml双蒸水洗脱,收集洗脱下的液体,即为纯化的寡核苷酸,NAP-10柱可以纯化长度在10mer以上的寡核苷酸,产率在90%以上。经NAP-10柱纯化后样品中盐的含量少于3%,*可以满足实验的需要。
2.丙烯酰胺凝胶电泳纯化
从合成柱上洗脱的寡核苷酸片段,冰冻、干燥、去氨水,溶于适量水中后,点样于15%~20%丙烯酰胺凝胶制备胶上,按10v/C1TI条件电泳,过夜。电泳完毕后,取下凝胶于EB染色后观察,或直接将含寡核苷酸片段的凝胶置于硅胶荧光板上(CMC板)紫外线灯下,根据分子质量的标准切下所需的区段(呈黑色),将胶块置于少量缓冲液(10mmol/LTris—HCl,pH8.0,lmmol/LEDTA,300mmol/LNaCl)中,捣碎胶块,25~42~C浸泡过夜(4~24h),或将胶块置于有少量缓冲液的透析袋中,通电情况下,寡核苷酸片段即进入透析袋中。洗脱的寡苷酸核片段以乙醇沉淀、洗涤,真空抽干后即可应用。
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