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胶体金标记蛋白的纯化

阅读:703发布时间:2011-12-3


(1)超速离心法:根据胶体金颗粒的大小,标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。

用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心(20nm金胶粒用1 200r/min,5nm金胶粒用1 800r/min)20min,弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g,4℃离心1h;20nm~40nm胶体金结合物,14 000g,4℃离心1h。仔细吸出上清,沉淀物用含1%BSA的PB液(含0.02%NaN3),将沉淀重悬为原体积的1/10,4℃保存。如在结合物内加50%甘油可贮存于-18℃保存一年以上。

为了得到颗粒均一的免疫金试剂,可将上述初步纯化的结合物再进一步用10%~30%蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。

(2)凝胶过滤法:此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋,在硅胶中脱水浓缩至原体积的1/5~1/10。再经1 500r/min离心20min。取上清加至Sephacryl S-400(丙烯葡聚糖凝胶S-400)层析柱分别纯化。层析柱为0.8 cm×20cm,加样量为床体积的1/10,以0.02Mol/L PBS液洗脱(内含0.1%BSA,0.05%NaN3,pH8.2者用IgG标记物),流速为8ml/h。

按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色,有时略混浊,内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物,随浓度的增加而红色逐渐加深,清亮透明,zui后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4℃保存。zui终可得到70%~80%的产量。
 


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