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上海永叶生物科技有限公司
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阅读:633发布时间:2012-5-5
IL-10由辅助性T细胞亚群THl和TH2,单核细胞、巨噬细胞、B细胞和角质细胞(keratinocyte)产生。其生物活性广泛,可选择性地抑制单核一巨噬细胞的某些功能,对T细胞、B细胞等的功能亦有明显影响。现已获得重组的鼠和人IL-10及其特异性McAb。B细胞等在正常状态下可分泌一定量的IL-10,用LIS刺激可使其产量明显增加,诱生高峰在孵育18h后。
(一)ELISA试验
用IL-10McAb包被反应板,以*结合的第二抗体进行夹心法ELISA检测IL-10活性或含量。
(二)生物活性测定法
可根据IL-10对抗原刺激THl细胞产生IFN-7的抑制作用测定其活性。若不能维持培养Tul细胞,可用PHA刺激的脾细胞代替。
1.向96孔培养板每孔加50/zLRPMI-1640和50ul待测标本,并设置IL-10标准品(40ne/mL)对照,每一标本及对照组均设置3个复孔。
2.混匀后,自H排每孔取50gL加入G排,混匀后,自G排每孔取501~L加入F排,如此类推直至B排,A排作为阴性对照。
3.以2 500rad~C。照射鼠脾细胞,洗涤并计数,用RPMI-1640调整细胞浓度至2X107/mL。
4.用RPMI-1640洗THl细胞,用含抗原的培养液(终浓度为0.04%鸡红细胞)调整细胞浓度至2X106/mL。
5.将步骤(3)和(4)所得脾细胞和T细胞等体积混合,如可能存在IL-2、IL-4或TGF-b时,加相应MeAb对照(抗IL-4 5弘g/mL;抗IL-2 2ng/mL;抗TGF-p10ng/mL)。
6.每孔加501aLT细胞、脾细胞、抗原混合液,37~C C02温箱中培养24h。
7.从每孔中取上清50/uL(注意勿吸出细胞),测上清的IFN-r,绘制标准曲线,并计算IL-10浓度。
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