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上海永叶生物科技有限公司
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阅读:1360发布时间:2012-6-9
IL-2主要由活化的CD4+细胞产生,通过自分泌和旁分泌作用于分泌IL-2的细胞本身或邻近的CD4+和CD8+细胞,是机体免疫网络中zui重要的调节因子。因此,IL-2活性的检测已成为评价机体免疫功能的重要指标之一。但体液中IL-2含量甚少,难以直接测定。通常检测PHA和ConA等丝裂原诱导单个核细胞在体外产生IL-2的能力来反映。
体外诱生和制备IL-2可用正常组织细胞(如人脾脏、扁桃体、淋巴结)及外周血单个核细胞,大鼠和小鼠脾脏细胞,各种传代细胞系(如人白血病Jurkat细胞系,小鼠胸腺瘤EL-4细胞系,长臂猿淋巴肉瘤MLA-144细胞系等)和一些T细胞杂交瘤。
1.人外周血单个核细胞诱生IL-2
(1)无菌取静脉血5mL,肝素抗凝。用淋巴细胞分层液密度梯度离心(2 000r/min×30min),分离单个核细胞。
(2)用Hanks液洗涤细胞2次,然后用含10%NBS的RPMI-1640*培养液调整细胞浓度为1×106/mL。
(3)于24孔培养板中,加入细胞悬液lmlJ孔,PHA 100pz/孔。
(4)37℃5%C0:条件下培养48h。
(5)吸出培养上清,2000r/rain离心20rain,收集上清,—20~C冻存待测。
2.小鼠和大鼠脾脏细胞诱生IL-2
(1)将小鼠拉颈致死,无菌操作取脾脏。仔细剪碎,加适量的Hanks液混悬,经100目筛网过滤,获得单个脾细胞:
(2)低渗或0.83%氯化铵处理,裂解残余红细胞。
(3)以含2%NBS的HBSS离心洗涤2次,用含10%NBS的RPMI-1640*培养液配制成5×106/mL脾细胞悬液,加入ConA使zui终浓度为5~10pg/mL。置37%,5%C02温箱中培养24—48h(视细胞转化情况而异)。
(4)离心沉淀,收集上清。—20~C冻存待测。
3.MLA-144细胞和EL-4细胞诱生ID2 MIA—144细胞可以自发分泌IL-2,按以下条件培养:起始细胞浓度为2X105/mL,终末浓度为1X106/mL,传代时间为48h:
EL-4细胞在十四酰佛波乙酸酯(tetmdecanoylphorbolacetate,TPA)刺激下可产生价11,-2。TPA为10ng/mL,起始细胞浓度为106/mL,培养48h,收集上清:
4.注意事项
(1)诱生剂浓度、培养条件和细胞浓度对结果均有明显影响,应进行预试验以确定*实验条件。
(2)培养器皿和研磨条件:24孔培养板培养细胞活率较高,但生长稍慢。玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不净引起细胞死亡,故应注意采取相应措施。大量培养时用大容量瓶比较方便,可减少操作中的污染。研磨组织可用玻璃匀浆器、不锈钢网和毛玻璃
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