用慢病毒筛选稳定细胞株,以G418筛选方法为例,筛选出稳定整合Neomycin抗性基因的细胞系.
A、 G418抗生素*浓度筛选
每种细胞对抗生素的敏感性不同,因此,准备建立稳定细胞系之前,需要确定能够在10-14天杀死细胞的*浓度.
方法如下：
1、将细胞稀释到1000个细胞/mL,接种到24孔板,每孔1ml.
2、接种后第二天在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选.3、每隔3天跟换1次培养液,保持G418浓度不变.
4、选择出在10~14天内使细胞全部死亡的zui低G418浓度来进行下一步的筛选试验.由于每种细胞对G418的敏感性不同,一般变动在100ug/ml～1000ug/ml范围.
B. 慢病毒感染细胞和稳定细胞系筛选
1、在6孔板培养皿内种植约5×10^4细胞CO2 孵箱培养24小时.
2、准备 3ml 培养基,加入Polybrene,终浓度为6-8 μg/ ml.将制备好的适量病毒颗粒加至上述培养基,轻吹混匀.去除旧的培养基,加入含病毒培养基.
3、病毒感染后 24小时,用新鲜的*培养基替换含有病毒的培养基,继续培养48小时.
4、换用含*浓度G418 的培养基.根据细胞敏感性不同,以后每隔3-5天换用新鲜的含有G418的培养基,以替换含大量死细胞的培养基.待抗性细胞长满以后,细胞转入10cm 培养皿,同时,留一部分细胞在原来的60mm 平皿内,待细胞长满后,收获细胞,在蛋白或mRNA 水平鉴定基因过表达或敲低效率.
Polybrene 配制：用 0.9%的NaCl 溶解Polybrene 干粉（浓度为10 mg/ml）,高压灭菌,可以在4 ℃稳定存放1 年,也可冻存于-20℃.干粉可以在4 ℃ 稳定存放数年.
G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中,加蒸馏水至10ml,过滤消毒,4度保存.
