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即用型大鼠VEGF  SP免疫组化染色试剂盒

产品编号：QD82178

试剂的保存：短期于4℃保存，长期于-20℃保存。

工作原理

血管内皮生长因子 (VEGF)是相对分子质量为(34～45) ×103的同源二聚体糖蛋白。人体内可形成多种异构体可以特异性地促进血管内皮有丝分裂的因子。VEGF是一种选择性促内皮细胞有丝分裂原,它能增加血管通透能力,促进内皮细胞增殖,对肿瘤的浸润和转移有重要影响。

链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质，分子量47000。同亲和素一样，对*分子有*的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍。亲和素是一个碱性蛋白质（IP=10），经改造后可以转变成中性蛋白质。链霉亲和素等电点接近中性，IP=6.0~6.5，对组织和细胞的非特异吸附很低，基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。根据研究，SP（StreptAvidin-Biotin  Complex）大约可形成上百个左右的过氧化物酶和数十个左右的链霉亲和素所构成的复合物。

应用范围

适用于免疫组织化学方法以显示待测抗原的分布，本试剂盒适用于常规石蜡包埋切片、冰冻切片，培养固定的细胞切片以及新鲜制备的血涂片、爬片等。

试剂盒中内容

1. 山羊血清封闭液：1ml(效价1：10，临用前用TBS或PBS稀释10倍)。用于组织切片的封闭。
2. 二抗：1ml（效价1：10，临用前用抗体稀释液稀释10倍)。亲和纯化抗体，标记长臂*，*标记抗兔IgG。
3. SP：1ml（效价1：10，临用前用SP稀释液稀释10倍）。链酶亲和素-过氧化物酶复合物。

用户自备试剂：

1. 粘片剂APES或Poly-L-Lysine。
2. 0.01M PBS，0.01M 枸橼酸盐缓冲液。
3. DAB显色试剂盒。
4. 免疫组化染色程序的选择：

用户需根据抗原/抗体的特点确定程序，多数情况下要先比较各程序染色结果。

石蜡切片染色程序:

1. 载玻片防脱片剂处理:可选择APES或Poly-Lysine。捞片后置烤箱58-60 ℃30-60分以使切片紧密粘附。
2. 切片常规脱蜡至水。
3. 30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4. 酶消化程序:滴加复合消化液5-10分钟。蒸馏水洗3次。也可以使用0.1%的*作消化液。热修复抗原:将切片浸入0.01M  枸橼酸盐缓冲液（PH6.0）,电炉或微波炉加热至沸腾  后断电，间隔5-10分钟后，反复1-2次。冷却后PBS（pH7.2-7.6）洗涤1-2次。
5. 滴加封闭液,室温20分钟。甩去多余液体, 不洗。
6. 适当稀释的一抗，37 ℃ 2小时左右或4℃过夜。PBS（pH7.2-7.6）洗2分钟×3次。（一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。）
7. 加*化二抗,37℃ 30分钟。PBS（pH7.2-7.6）洗2分钟×3次。
8. 滴加试剂SP,3 7℃ 30分钟。PBS（pH7.2-7.6）洗5分钟×4次。
9. DAB显色:使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水,加试剂盒中A,B,C试剂各50ul,混匀后加至切片。室温显色, 显微镜下观察显色反应，时间一般在5-30分钟之间。达到合适着色强度时（阳性较强，背景较低），即可终止反应（用蒸馏水洗涤切片）。
10. 苏木素轻度复染。脱水,透明,封片。显微镜观察。

注意事项：

1. 如果染色背景过高，在SP反应之后，DAB显色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN20的PBS（pH7.2-7.6）洗涤切片4次，单纯PBS洗2次，然后DAB显色。警告：DAB 为可疑致癌物，请采取必要的防范措施。
2. 热修复抗原可选0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH6.0）；也可以使用PBS、TBS等多种缓冲液。
3. 脱蜡不*，容易出现非特异性背景染色，建议免疫组化切片脱蜡与常规H.E脱蜡分开。
4. 如果将本试剂盒用于肝脏与肾脏等含内源性*含量丰富的组织切片，需要进行封闭的特殊处理。
5. 在超过有效期的试剂盒中一种或多种试剂活性可能降低，因此不得使用过期的试剂盒，不同批号间的试剂盒也不能交叉混用。