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莱克多巴胺（Rac）定量检测试剂盒（ELISA）

使用说明书

一、概要

β兴奋剂是一种人和兽医作为治疗哮喘的药物。在牲畜中超剂量使用可以脂肪组织转化为肌肉组织，由于能够显著改善脂肪率和生产效率，β兴奋剂往往被滥用于畜牧养殖生产中。已经有克伦特罗或其他β兴奋剂中毒的病例报道，近来又有一些非法使用莱克多巴胺（Rac）来替代克伦特罗作为饲料添加，并存在滥用现象。

通常情况下，HPLC或GC-MS是克伦特罗残留检测的确证方法，但是其前处理步骤繁琐、费用昂贵。酶联免疫快速检测试剂盒具有成本低廉、操作简便、一次处理样本量大等优点，已成为常规的初步筛查方法。本试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点，能zui大限度地减少操作误差和工作强度。

二、用途

定量检测动物尿液中莱克多巴胺（Rac）的残留。

三、检测原理

本试剂盒采用竞争酶联免疫试验。检测的基础是抗原抗体反应，微孔板预包被羊抗鼠IgG捕获抗体，加入鼠抗莱克多巴胺抗体后，会与捕获抗体连接。经过孵育及洗板后，加入标准品、样品及莱克多巴胺酶标记物（Rac-HRP），游离的莱克多巴胺（Rac）与莱克多巴胺酶标记物（Rac-HRP）竞争莱克多巴胺抗体结合位点。经过孵育及洗板后，加入底物并孵育。结合的酶连接物将底物转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450 nm 处测量，吸光度值与样品中的莱克多巴胺浓度成反比，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中莱克多巴胺的含量。

四、检测限

检测限：0.05ng/ml（0.05ppb）

五、特异性

     交叉物                            交叉率（%）

Dobutamine……………………………………5.3

Ritodrine………………………………………3.6

Ractopamine Gluc.A…………………………1.0

Ractopamine Gluc B……………………………384

(1S,3S) –Ractopamine…………………………2.1

(1R,3S)-Ractopamine……………………………0.9

Isoxsuprine………………………………………0.3

Salmeterol…………………………………………0.3

Fenoterol…………………………………………0.1       

Clenbuterol……………………………………<0.01

Salbutamol………………………………………<0.01

六、试剂盒组成

每一个盒中的试剂足够进行 96 个试验（包括标准测定），试剂盒中的组份如下：

1、96孔酶标板1块（12孔×8条）：预包被羊抗鼠IgG

2、标准液×6瓶（1ml/瓶）：

0ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.1ng/mL

3、酶连接物（6mL）：辣根过氧化物酶标记的莱克多巴胺工作液

4、莱克多巴胺抗体（6mL）：鼠抗莱克多巴胺单克隆抗体工作液

5、底物液A（6mL）：过氧化脲

6、底物液B（6mL）：四甲基联苯胺（TMB）

7、终止液（6mL）：2N H₂SO₄

8、浓缩洗涤液（25×）（25mL）：含Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）

9、其他：封板膜3张，自封袋1个，说明书1份

七、样本处理

处理任何样本，必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。取50μL清亮尿样直接测定，如尿样浑浊3000转离心10min，取上层清亮尿液测定，暂不使用的样本应于-20℃冷冻保存。

八、检测步骤

仔细的洗涤非常重要。避免在操作过程中微孔出现干燥。

1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20-25℃）平衡30min以上。

2、准备：取出需要数量的微孔板，将用剩的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。将微孔板条插入微孔架，标准品和样品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置。

3、加抗体：每孔加入100μL稀释后的抗体溶液，37℃恒温箱孵育30分钟。

4、洗板：倒出孔中的液体，将微孔架倒置在干净吸水纸上拍打，以保证*除去孔中的液体。每孔加满稀释后的洗涤工作液，静置20秒钟，甩去液体，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。

5、加标准品/样品：加入50μL标准品或处理好的样品到各自的微孔中，标准品和样品做两个平行实验，然后加入50μL稀释后的酶连接物到微孔，小心地充分混合，37℃恒温箱孵育30分钟。

6、重复3的操作。

7、显色：每孔先加入底物液A 50μL，再加入底物液B 50μL，37℃避光孵育15min（如果显色过浅，可适当延长孵育时间，反之亦然）。

8、测定：每孔加入终止液50μL，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。

九、结果判定

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以*个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ppb标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以莱克多巴胺标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中莱克多巴胺的实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（索取）

十、注意事项

1、严格按照说明书操作时间，每加一种试剂前需要将其摇匀，各操作步骤紧凑进行。

2、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

3、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

4、试剂变质的迹象

底物有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。

5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

6、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色20min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到25min（或更长），但不得超过30min。反之，则减短反应时间。

7、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

十一、贮存条件及有效期

贮存条件：2-8℃、干燥避光防潮。

有效期：在正确贮存条件下，有效期为12个月。