现在ELISA试剂盒除非是测定抗体的以外，一般使用的是双抗体夹心法，此种方法大多数用的是增强的双抗体夹心法，即使用*-亲和素系统，还有少数的指标可能使用竞争法，这类方法适用于半抗原的测定。
具有复杂结构的多表位蛋白抗原，其双抗体夹心法中的一个抗体必须用单抗，否则背景很高。当然如果两个都是单抗(这两个单抗针对不同表位)，那么测定的线性范围就较宽，试剂盒性能就较好；一个用单抗，一个用多抗，测定的灵敏度会较高。
某些简单的化合物用ELISA试剂盒测定时，因为没有两个或以上的表位，一般只能作为半抗原，只能用竞争法测定。如果你发现有测定简单化合物(如雌激素、NO等)用双抗体夹心法作测定原理时，这个试剂盒你就要怀疑了。另外还要说明一步双抗体夹心法与两步双抗体夹心法的区别。
一步双抗体夹心法的吸光度-剂量曲线呈钟形，随着待则标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应"(hookeHect)，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象"(zonephenomenon)。所以当使用一步双抗体夹心法时，样品浓度太高，有时会出现测不出来的现象，此时要作适当的稀释才能准确测定。
试剂盒的组成：用双抗体夹心法作为测定的方法时，ELISA试剂盒的组成一般包括： 已包被单抗的酶标板：一块，有96孔的，也有48孔的，可拆缷，外面有铝箔袋密封，打开后有干燥剂，实验时暂未使用的酶标条要连带干燥剂密封好，放在4℃冰箱中妥善保存。
