ELISA试剂盒动物细胞培养技术

ELISA试剂盒在体外进行培养.使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。

细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响;二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。

细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等

这次的动物细胞培养是一个精细的，需要有步骤、有计划的进行的实验。主要步骤有：1、清洗与灭菌;2、培养基配制;3、Hanks、D-hanks液和消化液的配制、4、细胞传代培养;5、细胞的冻存与复苏。可分几次小实验进行操作。

Ⅰ清洗与灭菌

一、实验目的

能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。

二、实验原理

清洗与消毒是组织培养实验的*步，是组织培养中工作量zui大，也是zui基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不*有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0.1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，ELISA试剂盒即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。

三、实验材料、用品

1、材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0.22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0.22 μm，过滤器(直径25)。

2、药品：70%或75%酒精，0.1%新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0.5%过氧乙酸，乳酸，37%甲醛，*，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC水[体积分数0.1%的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。

3、仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。

四、实验步骤

(一)实验器具清洗

l 玻璃类 1、主要有：培养瓶，血清瓶，小青瓶，移液管，离心管，试管，培养皿等。

2、清洗步骤：

泡在含有洗洁净的自来水中→捞出来用毛刷将实验器具各个面刷洗至少25遍→自来水冲洗25遍→过一遍一蒸水→泡入铬酸,过夜(24h左右)→从铬酸中捞出器具，自来水冲洗25遍→过三遍一蒸水，三遍三蒸水→烘箱内烘干→收入柜子备用→用前高温灭菌(121℃，25min)→烘干→使用。

注意：新的玻璃器具先要泡盐酸1天，然后清洗步骤与上面相同。

l 塑料类

1 塑料类器具主要包括：孔板，大枪头，瓶盖，滤器，*等。

2 清洗步骤：

(1)孔板，*

泡在有洗洁净的自来水中→用超声清洗仪超声3遍(每遍1小时，200C)→在含有洗洁净的自来水中用毛刷或者纱布将各个面刷洗至少25遍→过一遍一蒸水→泡入盐酸过一个礼拜→从盐酸中捞出后自来水冲洗25遍→过三遍一蒸水(每遍3次)，三遍三蒸水→烘箱内烘干→收入柜子→用前包装好照钴→使用

(2)大枪头，盖子，滤器

在含有洗洁净的自来水中用毛刷或者纱布将各个面刷洗至少25遍→用超声清洗仪超声1遍(每遍45分钟，200C)→自来水冲洗→过三遍一蒸水(每遍3次)，三遍三蒸水→烘箱内烘干→收入柜子→用前包装好灭菌→使用

注意：(1)烘孔板时温度不应太高，烘干后用报纸包裹，装入箱子内，照钴，便可使用。

(2) 新的培养瓶盖子泡旧5%*1天→再用2%NaOH煮20min →自来水冲洗→洗洁精清洗→用超声清洗仪超声1遍(每遍45分钟，200C)→冲洗15遍→过三遍一蒸(每遍3次)→过三遍三蒸水→烘干使用

(二)包装与消毒

2、包装

洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸(油光纸)等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。比如小青瓶，试管，移液管，血清瓶，培养瓶，离心管，孔板，枪头，针式滤器等的包装。其中针式滤器包装之前要装好滤膜，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中 。

2.1 包装分类

局部包装：较大瓶皿如细胞培养瓶，烧杯，容量瓶，三角瓶， 消毒筒以及体积较小，但瓶口包装方便的容器如*瓶等的包装，通常采用局部包装。

全包装：体积较小的培养瓶皿，注射器，ELISA试剂盒胶塞及不便局部包装的用具如金属器械等，需采用全包装，现多采用直接装入铝饭盒的方法。用铝饭盒来封装小培养瓶，胶塞和胶帽等很好，但往往因盖不严紧使用期限不宜太长。因铝饭盒不透明，在盖子宜写上用品名称以便于确认，吸管在装入消毒筒之前，先用少许脱脂棉将吸管接口端堵塞，松紧度适宜，过松易脱落，过紧不透气，妨碍使用;然后装入消毒筒中，消毒筒底部应垫以软纸或棉花以防吸管装入时折断管尖;zui后再包装入筒中封口。