实验室试验小技巧

平时在实验室zui常听到的一句话就是“今天某某试验没做好是为什么？今天某某试验没出结果是什么原因？今天某某试验为什么会是这样的呢？" 等等。然后仔细一查找原因，往往是由于操作上面的不认真，或是一些小小的细节没有注意到。以下是集各路朋友的一些经验，与大家分享：

11. 在把蛋白胶做成干胶时，很多时候会因为有气泡使胶裂掉，我的经验是在做胶时加上层膜前在胶上多加些水就不容易进气泡了，还有就是高温烘胶，我喜欢放到60度烘箱里烘，ELISA试剂盒这样水分蒸发速度快，即使有一些小的气泡也不会有影响，呵呵，这是经验之谈，我从来都没失手过，大家可以试试

12. 做大肠表达时确定蛋白是否表达一般要煮样做诱前诱后检测,但很多时候煮出来的很黏影响跑胶效果.我发现如果现用8M Urea重悬细菌再煮效果会有极大改善.

注:不能用Gu-HCl代替

13. 我也推荐几个偷懒的方法

1. 做SDS-PAGE跑胶通常都是现配现用,但配胶要>1h,所以如果想第二天睡个懒觉而又不耽误跑胶可以于前一天晚上做好浓缩胶和分离胶,待凝聚后不要拔下梳子,把含胶玻璃板从制胶槽取下,用保鲜膜包上,注意玻璃板上下两边缘会有气体,所以需要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发.然后放4度过个夜.第二天直接拔下梳子行后续.国外好多公司出售脚既是如此,可以保存上星期.

2 .配置分离胶或者非变性胶时因胶凝时收缩可导致加样孔变浅.可以将加剩的胶放入4度以降低凝聚速度,而将凝胶放入37度促聚,并随时用4度加剩的胶补充下降的胶面.另外将胶横放与水平面成~10度角也可以减少收缩的影响.

3 .推荐一个节约抗体/时间的做法:

同时跑2块胶,同时转膜,然后两块膜背靠背放入同一封口膜同时封闭,同时一抗二抗(是用转轮,这样效果好.如果是摇床,隔一段时间帮它们翻个身以保证两张膜的正面都有机会与液体充分接触.一起洗膜(可以稍微加强洗膜也可以不做.我zui多一张盘子里放4张膜而没有影响洗膜).可分别或同时压片.这样就可以节约一半抗体和接近一半时间而不会影响结果.

或者另外一个就是孵育后的抗体不要扔,好的抗体可以反复做好几张膜呢.但每次都会减弱,效果不如上面一种方法.

14.做western blotting 转膜时，胶放在转膜缓冲液中一段时间，待胶在含有甲醇的缓冲夜中缩小的差不多后装 好转膜装置，我的经验是把膜印在胶上直接在膜上画出预染maker条带，方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染maker很清楚，等转膜后就不是分辨的很清楚了。不过要注意画好预染maker后就不要使胶和膜发生对位移动了，以防maker失去参照价值。

15. 超滤zui合适用于蛋白的浓缩，更换缓冲液和除盐，对于按照分子量进行初分离的效果不是很好，理论和现实是有很大差别的

16. 关于Western Blot

1）器具的清洁非常重要，开始做前，为了安全，ELISA试剂盒尤其是装胶的厚薄玻璃板，可以先用中性洗涤剂和自来水反复冲洗，确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗2－3遍，然后用去离子水冲洗一遍。zui后用95％酒精再擦一遍后晾干备用。

2）配胶现用现配，先配下层胶（分离胶），后配上层胶（浓缩胶或积层胶），而且在临灌胶前加APS并迅速混匀，即用移液枪抽吸与注入1－2次即可。

17.跑蛋白page的时候，一开始用加样针，太麻烦，发现用20ul枪+普通小白枪头点，非常省事。另外，点样时有可能看不清孔在哪，看远离你的那面胶，孔有反光的。点样也点你对面的那块胶，省的总低头，干咱这行的容易得颈椎呀，爱惜自己。

18. 垂直电泳时，可在电泳糟中放入*小瓶等，可自然使液面提高而不影响电泳，又很节约电泳缓冲液。

19. 我们有时要沉淀东西时，由于沉淀量很少，离心完之后不知道到底有没沉淀下来东西，由于量很少，不好观察，所以离心时建议按特定的方向放置离心管，这样你就可以在离心之前确定沉淀该沉淀到管子的大致部位，这样离心后就可直接观察那有没有沉淀，避免满管子找，另外看沉淀时可以对光看，这样就是颗粒状的细小沉淀也能看见的。

20. 大家都知道PMSF有剧度，以前都是知道浓度和要配的体积的基础上,算出要称多少毫克的PMSF,其实也可以先称PMSF,称多少算多少,再调整异丙醇的体积，到达你所要的浓度。这样就避免了你长时间和它接触。

21. 跑好SDS-PAGE胶的一些体会。

1. 清洗好玻璃板，不要偷懒，很多时候跑完电泳撬胶时会因为玻璃板不干净胶粘在板上把胶撬破。

2. 配胶时不要反复用枪混，稍微摇混就可以了，用枪混多次会导致胶凝不好影响电泳图的分辨率。

3. AP分装成500微升一管保存放-20度，避免AP用太久失效。

4. 倒胶时把玻璃板中的水用滤纸尽量吸干，因为微量的水存在会影响配的胶浓度。

5. 尽量不用过个夜放室温或者四度的胶，也回影响胶 的分离效果。

6. 电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板，在一平皿里装好水，把有胶一面的放在水中晃动几次胶很容易就脱落下来，一点没有问题，方便的很。

7. 点样时样品别忘了离心这步，因为上样含有固体沉淀会影响电泳图分辨效果。

8. 尽量在冰浴状态下跑。

22. 做2-DE做的比较多，总结了几个小窍门：

1.一向电泳时，盐离子容易聚在　胶槽的两侧．剪一小段ＩＰＧ胶条放在两侧，构成盐桥，电压就容易上去了．避免一向电泳不好影响zui后实验　　结果．

2. SDS－PAGE时,在灌胶之前,一般大家都会用凡士林封底, 在SDS－PAGE

电 泳之前又必须把凡士林搽干净,很是麻烦,我的经验是:不用凡士林,取少量未加Ap的分离胶,按比例加2倍量的Ap,然后灌入板间,等上几分钟,待胶凝固后就可以接着灌分离胶了.方面,效果好!

23. 蛋白质纯化时，蛋白质降解可能与超声破菌保持冰浴有关，之前建议加pmsf，建议在上柱子洗脱的时候也加pmsf（蛋白降解抑制剂），一定要用之前再加。

24. 做透析的时候，拿一个5ml的枪头或者是其他类似的东西，剪短，穿过个塑料泡沫之类的面积比烧杯大东西，然后把透析带一端扎紧，另一端开口绑紧在5ml枪头下端，扎紧得那端也可以弯过来绑成u字型。这样就可以用1ml的枪穿过5ml的枪头的孔，另一只手调整透析带，来加样取样，省去了总绑透析带的麻烦，对同一个蛋白大量多次透析非常方便

25. *次发贴说一下自己的小经验，希望版主能给我一分，每次看到好东西因为没分都没法下，好羡慕有分的人啊。当然也不能不劳而获，说一下自己的实验技巧给大家分享。

1. 配SDS-PAGE胶时，用枪头混匀比较麻烦，而且费时费力，效果也不好。可以剪一小段夹文件的那种曲针做转子放到配胶的小烧杯里，在磁力搅拌器上边搅边加入各溶液，这样加完也就混匀了，直接灌胶即可。

2. 上面的站友也说过，上样用黄枪头就行，我也一直在用，根本不用注射器，方便的很，建议大家也试试。

3.电泳后考马斯亮蓝染色一般要1h到2h，脱色也要2h左右，麻烦的很。现在给大家说一个简单的方法，是我从一个师姐那里学到的。

加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久，否则冰醋酸就挥发了）。然后放水平摇床上摇20分钟，zui多半小时就染好了。

脱色也很简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。方便快捷！

放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。

26. 我也说说我的小经验。可能大家都知道，请别笑话我。

1、配胶时一定要掌握好时间，不要因为过度赶时间，而造成以后的条带粗大，压不成条带，且消耗很多试剂和时间。

2、加样时，冲洗加样器可用双蒸水，用电泳液会使加样器中有很多的泡沫。或许是因为SDS的原因吧？

3、对于大分子蛋白质，转膜过个夜更好。滤纸的张数可以适当减少。

4、在跑样时同时加入MARKER有助于正确识别所需的蛋白位置，减少NC膜的消耗。

5、一抗、二抗的浓度不要太高。

6、做ECL显影时，根据荧光的亮度调整时间。泡完显影液，胶片应用水洗一下，以减少定影液变黄。

7、和有经验的同学交流，也是非常重要的。知识的交流有助于试验的成功。

这是我目前的一点拙见。

27. 推荐一个省质粒试剂盒硅胶柱与溶液的方法：

所有试剂使用手提质粒自己配置的溶液一、溶液二、溶液三（代替试剂盒的solution1、2、3），然后一比一的与饱和*或碘化纳（代替结合缓冲液）混合，就可以让质粒在硅胶上结合，而试剂盒的硅胶柱可以重复使用，没有试剂盒溶液量的限制，只要是一样的质粒我想提几管就提多少。

顺便说一句硅胶柱也可以用自己买的硅胶粉末代替，离心后倒掉硅胶柱上面的上清就可以，用起来不象柱子方便。效果比手提的要好要快

28. 做WB时,样品比较多, 又怕放时间长了对蛋白样品不好,而且确定以后肯定要做某个抗体,只是一时没有决定.那么你可以选择先做SDS-PAGE,并转膜. 然后把PVDF膜凉干, 放四度保存. 以后拿出来封闭后,加抗体就行了. 蛋白在膜上,且已经分离, 比保存在BUFFER里面的蛋白肯定更可靠。29. 今天作his纯化的时候，又琢磨了一个窍门，与大家分享。我得样品比较多，几百ml，而柱子不够大，只有10几ml，跑来跑去的上样，还总得记着，太麻烦了。于是，我就刷干净了一个烧杯，装了我的样品，找了一个细胶皮管，当连通器，就像鱼缸换水一样，用5ml枪在一头一吸，液体流出来，放到纯化柱里，调好烧杯的位置，两个液面一样平了，上了好几个小时了，没有问题，现在调低速度，过个夜上样

30. 能导致PAGE胶不凝的原因主要有三个：

1、配胶中用到的主要试剂的配置。

主要就是30％的丙稀酰胺的配置。 粉末状的丙稀酰胺和甲叉丙稀酰胺使用不应该超过一年，因为丙稀酰胺会吸潮水解，这样以来丙烯酸的含量就会加大，从而导致page胶不凝。

2、温度。

温度高时凝固快，但是亦不宜过高，因为温度变化会影响交连物的孔径大小。所以温度在25度zui为合适。

3、氧气。

氧气是凝固的终止剂，所以不能让胶中出现气泡。

虽然都是些看起来听低级的错误，但是不注意还是会犯。

31. 我做2维蛋白电泳，也有些心得：

1、向电泳玻璃板内加入胶条时，先在缝隙中加入配好的溴芬兰缓冲液，要加满，再将胶条贴后面玻璃板壁用薄塑料片将胶条缓缓推下至凝胶上缘，这样可以很好的避免胶条下形成空气泡。

2、 能做出好的图谱已经很不容易了，如果在扫图时撕破实在可惜，所以扫图要小心，将凝胶转移到扫描仪时可以用塑料隔片在下面托着，同时保持有些水，这样就安全多了。

32. 凑个热闹说两句吧

1、sds-page胶如果配好装好倒入内槽液以后，发现内槽液稍有渗漏，可以把外槽液多加一些，加满，加到与内槽液相齐，这样就可以继续正常跑胶，不用浪费已经加进去的内槽液

2、至于染色脱色的问题，我们这里一直是染色：加热半分钟，摇20分钟；如果染液不是新配的，就加热半分钟摇十分钟，凉透了再重复一次即可

脱色也一直是用去离子水煮两三次即可

3、不知道大家都是怎么做酶切的，我的体会是，酶切质粒时，两个酶分别单酶切比直接双酶切效果要好很多。我有一次双酶切两次都没连出来，后来分步单酶切，连接效率几乎100%。

可以*个酶切完后直接把体系热失活，（根据酶说明书上一般是65度20min）然后直接向里面补第二个酶

或者*个切完后用氯仿抽提，把蛋白提出

或者中间做一次回收，这个就要考虑回收效率和损失的问题了，但是这样除蛋白zui*

前两个方法我们这都是有人做过的，已经都很好用了

33. 俺也来说说关于Bradford法蛋白浓度定量和DTNB法巯基浓度定量的一点体会：

我是做蛋白修饰巯基后，通过这两种方法的定量来间接反应修饰的程度。一路摸索过来，也有半年有余；zui大的体会就是不要急于求成，ELISA试剂盒直接实验，首先检测修饰体系是否对方法有影响，修饰基团是否会在595nm和412nm下有特定的吸收，修饰后修饰试剂本身是否会有变化，对蛋白整体结构造成影响，其次再谈具体修饰比例和程度。对于巯基浓度测定方法，有四种（Anal Biochem. 1998 Dec 1;265(1):8-14），而DTNB本身虽然灵敏度不高，但是重复性和抗干扰是*的了。

34. 考马斯亮蓝染色后的脱色，如在脱色液中加数张捏成条状的Kimwipes纸（国外实验室常用，相当我们的擦镜纸，全棉纤维制造），由于染料吸附到纸纤维上，脱色加速。 待纸着色较深时，更换新纸条，不用换液。我想脱脂棉或纱布也是一样的。但滤纸等可能不行，会溶掉。

半贴壁细胞如SP/0或杂交瘤细胞传代时，不用吹打或刮落。先将上清吸出，适当拍打培养瓶（当然是塑料瓶，玻璃瓶拍碎了别找我），即可见贴壁细胞脱落，加培养基混悬即可。注意，过力拍打培养瓶会裂，特别是瓶颈。