基因与载体的酶切和连接

    一般来说，在将目的基因导人宿主菌体内前，需要把目的基因与载体连接在一起构建重组载体。要进行有效的连接，必须先利用生物酶将目的基因和载体切割成合适的DNA片段。识别和切割双链DNA分子内特殊核苷酸顺序的酶统称为限制性内切酶，简称限制酶。从原核生物中已发现了约400种限制酶，根据它们对DNA部位识别和切割的特异性，可分为I型、Ⅱ型和Ⅲ型。I型和Ⅲ型限制性内切酶切割DNA时都需要消耗ATP，并且具有甲基化酶活性，其中I型酶在其识别位点约1000bp以外处随机切割DNA；Ⅲ型酶在其识别位点附近进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。它们在重组DNA技术中没有太大用处。只有Ⅱ型限制性内切酶被广泛应用于DNA分子的体外重组。ELISA试剂盒

    与I型和Ⅲ型限制性内切酶相比，Ⅱ型限制性内切酶有如下特点：①识别特定的核苷酸序列，长度一般为4、5或6个核苷酸，通常具回文结构(palindromic structure)；⑦具有特定的酶切位点，即限制性内切酶在其识别序列的特定位点对双链DNA进行切割，切割后形成黏末端(或平末端)；③没有甲基化修饰酶功能，一般只需要MgH 2+ 。不需要ATP和S一腺苷一L一蛋氨酸作为辅助因子。

    Ⅱ型限制性内切酶在双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列称为识别序列或识别位点。它们对碱基序列有严格的专一性，被识别的碱基序列通常具有双轴对称性，即回文序列(Dalindromic sequence)。例如，从大肠杆菌中分离鉴定的EcoR I是zui早发现的一种Ⅱ型限制性内切酶。EcoR I够特异地结合在一段含这6个核苷酸的DNA区域里，在每一条链的*和腺嘌呤间切断DNA链。DNA链经EcoRI对称切割后会产生两个突出的5'-磷酸单链末端，每个末端有4个核苷酸延伸出来，相对应的两个单链末端的碱基序列互补，因而称为黏性末端。

    有些Ⅱ型限制酶，如表6．2中的Pst I，它识别序列5'-CTGCAG一3'，并在A与G之间切割DNA双链产生3'一突出黏性末端。还有些限制酶，如Bal I，切割DNA链后产生平齐的末端片段，成为平末端(blunt end)。ELISA试剂盒

    另外，也有一些不同来源的限制酶虽然识别不同的DNA序列，但切割产生的却是相同的末端，这些酶称为同尾酶(isocaudamer)。例如，限制酶BarnH I、Bcl I、BglⅡ和Xho Ⅱ都能识别各自的6核苷酸序列，且切点都在同一位置，依次为GGATCC、TGATCA、AGATCT和PuGATCPy．因此产生的DNA片段都具有一个相同的单链5'末端(GATC)。显然，由同尾酶产生的DNA片段可以通过其黏性末端的互补作用彼此连接起来，因此同尾酶在基因克隆中非常有用。由两种同尾酶分别产生的黏性末端共价结合而成的位点称为“杂种位点"，在多数情况下，这样的“杂种位点"将不再被原来的两种同尾酶识别，但也有例外，如Sau 3A I产生的黏性末端与其同尾酶BamH I、Bcl I、Bst I、Bgt Ⅱ、XhoⅡ中的任何一个产生的黏性末端结合而成的“杂种位点"，均可被Sau3A I识别和切割。

    目的基因被限制性内切酶切割后，所获取的DNA片段与载体的连接是通过DNA连接酶(DNA ligase)催化双链DNA缺口处相邻的两个脱氧核苷酸残基上的5'-磷酸基和3'-羟基连接形成共价的磷酸二酯键。常用的DNA连接酶有两种：一种是由大肠杆菌染色体上相关基因编码的，叫做DNA连接酶；另一种是由大肠杆菌T4噬菌体DNA上基因编码的，叫做T4DNA连接酶(也常写做T4DNA连接酶)。这两种DNA连接酶除了前者以NAD+为辅助因子，后者以ATP为辅助因子外，其作用机理差别不大。由于T4DNA连接酶制备比较容易，还可以连接平末端，因此在DNA重组实验中广泛使用。DNA片段的体外连接方法主要有以下几种。

(1)带有互补黏性末端片段间的连接用相同的酶或用同尾酶处理可得到带相同黏性末端的片段。为了与这类外源DNA片段连接，质粒载体也必须用同一种酶处理，得到两个相同的黏性末端。因此，就造成连接反应时外源DNA片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串联成寡聚物，而且也不容易控制连接方向。要解决这一问题，一方面可以调整连接反应中两种DNA浓度。以便使正确的连接产物数量达到zui高水平；另外，也可将载体DNA的5'端磷酸基团用碱性磷酸酶去掉，zui大限度地抑制质粒DNA的自身环化。这样带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连产生一个带有两个缺口的DNA重组子，这样的重组DNA分子仍然可以转入受体菌，并在宿主细胞内完成缺口的修复。

(2)带有平末端片段间的连接这种片段是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶处理产生的，或者是由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比较低，因此所需要的T4DNA连接酶和外源DNA及载体的浓度均较高。有时还需加入低浓度的聚乙醇(PEG8000)以促进DNA分子凝聚，从而提高连接效率。但是，即便如此，平末端直接连接的效率仍不高。

(3)DNA片段末端修饰后进行连接待连接的两个DNA片段经过不同的限制性内切酶切割后，产生的末端未必都是互补的黏性末端，或者未必都是平末端，无法进行连接。这种情况下，连接之前必须对两个末端或一个末端进行修饰。修饰的方式主要是将黏性末端修饰成平末端，或将平末端修饰成互补黏性末端。有时为了避免两个DNA片段自行连接成环形DNA或多聚体，也可将载体DNA的5'端磷酸基团用碱性磷酸酶去掉，修饰成较为稳定的一OH。

(4)人工接头分子连接 在两个平整末端DNA片段的一端接上用人工合成的寡聚核苷酸接头片段，这里面包含有某一限制酶的识别位点。经这一限制酶处理便可以得到具有黏性末端的两个DNA片段，进一步便可以用DNA连接酶把这样两个DNA分子连接起来。ELISA试剂盒