LDH法原理和实验步骤

一、原理

    活细胞的胞浆内含有LDH。正常情况下，LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDH释放到细胞外。LDH 可使乳酸锂脱氢，进而使NAD还原成NADH，后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT 接受H＋被还原成紫红色甲月赞类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定。

二、仪器和材料

    酶标仪、YAC-1细胞、Hank's液（pH7.2～7.4）、RPMI1640*培养液、乳酸锂或乳酸钠、硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）、NAD、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.2）、1%NP40或2.5%Triton

三、实验步骤

1、LDH基质液的配制

乳酸锂5×10-2mol/L

硝基氯化四氮唑（INT） 6.6×10-4mol/L

吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS） 2.8×10-4mol/L

氧化型辅酶Ⅰ（NAD） 1.3×10-3mol/L

将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液中（pH8.2）

2、靶细胞的传代（YAC-1细胞）

实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640*培养液调整细胞浓度为4×105个 /mL。

3、脾细胞悬液的制备（效应细胞）

    无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，或用 Hank's液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍 Hank’s液及8mLHank’s液，1000rpm，10min离心，用1mL含10%小牛血清的RPMI1640*培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数（活细胞数应在95%以上），用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），zui后用RPMI1640*培养液调整细胞浓度为2×107个 /mL。

4、NK细胞活性检测

    取靶细胞和效应细胞各100μL（效靶比50：1），加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞zui大释放孔加靶细胞和1％NP40或2.5%Triton各100μL；上述各项均设三个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养4h，然后将 96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应3min，每孔加入 1mol/L的HCl30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值（OD）。

按下式计算NK细胞活性，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项实验结果阳性。

反应孔OD－自然释放孔OD

NK细胞活性（%）＝ ────────────────── ×100%

zui大释放孔OD－自然释放孔OD

四、数据处理及结果判定

    NK细胞活性需进行数据转换，X＝Sin-1 ，式中P为NK细胞活性，用小数表示，然后再进行方差分析，在进行方差分析时，需按方差分析的程序*行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

五、注意事项

1、靶细胞和效应细胞必须新鲜，细胞存活率应大于95％。

2、比色时环境温度应保持恒定。

3、LDH基质液应临用前配制。

4、在一定范围内，NK细胞活性与效靶比值成正比。一般效靶比值不应超过100。