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DNA 连接

时间:2011-4-6阅读:599
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DNA分子的体外连接就是在一定条件下, 由DNA连接酶催化两个双链DNA片段组邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程, DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。
带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此,必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度,以便使“正确”连接产物的数量达到*水平,此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA和载体的体外连接反应,也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸(未脱磷),可形成4个新的磷酸二酯键;如载体DNA已脱磷,则只能形成2个新的磷酸二酯键,此时产生的重组DNA带有两个单链缺口,在导入感受态细胞后可被修复。
 

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