免疫组织化学方法

www.hbzhan.com/st47745/product_1661305（一）酶标记抗体组化法

　　酶标抗体组化技术是一种综合定性、定位和定量，将形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。

　　1、基本原理

　　酶标抗体技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性的单克隆抗体，是特异性强的价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在*抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组织化学间接染色法。

　　（1）标本的制备和处理

用于酶标抗体组化技术的标本有组织切片（冷冻切片和石蜡切片）、组织压印片。标本的制作和固定与荧光抗体技术相同，但尚需要一些特殊处理。

　　（2）标记酶

　　用于标记的酶应具备以下几点：

　　① 酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于在光镜或电镜下观察。

　　② 所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位。

　　③ 较易获得的酶分子，有商品出售。

　　④ 中性 pH 时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存 1-2 年活性不应改变，且酶的催化活性（ Turnover ）越高越好。

　　⑤ 酶标过程中，酶与抗体连接，不能影响二者的活性。

　　⑥ 被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。

　　其中 ① 、② 两点zui重要，因为容易显示的酶并非均能形成不可溶性的复合物。一般认为，辣根过氧化物酶（HRP）较佳，是zui常用的一种酶。

　　除 HRP 外，碱性磷酸酶（ALP）和葡萄糖氧化酶（GOD）也较常用。

　　（3）底物显色剂

　　① DAB （3，3-二氨基联苯胺）：显色后阳性反应产物呈棕褐色。

　　② AEC （3，氨基-9- 乙基卡巴唑）：显色后阳性反应产物呈红色或紫红色。

　　2、以 PRRSV 为例介绍一下染色程序。

　　（1）切片准备：将低温保存的切片37 ℃预热 5分钟 。

　　（2）常规脱蜡： 二甲苯15分钟；100% 乙醇 5分钟；100%乙醇1分钟；90% 乙醇 1分钟；75% 乙醇 1分钟。

　　（3）抑制内源酶：1% 盐酸酒精（75% 乙醇 99mL 加 1mL 盐酸）作用10分钟； 3%过氧化氢水溶液作用15分钟。

　　（4）蒸馏水洗 2 次。

　　（5）用 0.05% *37 ℃消化2分钟。

　　（6）PBS洗2次，擦干周围后用组化（蜡）笔沿切片周边画一个圈 。

　　（7）封闭：正常马血清1：20倍稀释， 37 ℃ 孵育20分钟。

　　（8）加一抗（1 : 800倍稀释的PRRSV单克隆抗体 Mab 11），37 ℃孵育1小时或37 ℃孵育0.5小时后4 ℃过夜。对照片不加一抗。

　　（9）PBS 洗 3 次。

　　（10）加二抗（HRP 标记的羊抗鼠 IgG 1 : 100X 稀释）37 ℃孵育1小时。

　　（11）PBS洗3 次。

　　（12）加AEC显色5~10分钟。

　　（13）苏木素衬染10秒钟。

　　（14）自来水洗2分钟。

　　（15）待切片自然干燥后用水溶性封片剂封片。

　　（16）镜检、观察记录结果。

　　（二）葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫检测技术

　　葡萄球菌蛋白A（SPA）是一种从*细胞壁分离的蛋白质，由于它的一些免疫学特性，使其成为免疫学上一种极为有用的工具。葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫检测技术是根据它能与多种动物IgG的Fc 端结合的原理，用SPA标记物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的各种免疫检测实验。

　　1、基本原理

　　SPA 具有和人及多种动物如豚鼠、兔、猪、犬、小鼠、猴等 IgG 结合的能力，可解决不同动物检测时，需分别标记相对应的二抗的问题。 SPA结合部位是Fc段，这种结合不会影响抗体的活性。 SPA具有的结合力是双价的，每个SPA分子可以同时结合两个IgG分子，也可一方面同IgG相结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、、胶体金和铁蛋白等相结合。但需注意的是SPA 对 IgG 免疫球蛋白亚型的结合有选择性，如SPA与人IgG亚型：IgG 1、IgG 2和IgG 4有结合力，不结合IgG 3。只结合IgA 2 ，而不结合 IgA 1。SPA与禽类血清IgG不结合。因此应注意可能出现的假阴性结果。SPA 常用 HRP 标记，可应用于间接法。

　　2、染色程序

　　染色程序基本同酶标抗体法，仅二抗改用 SPA-HRP。

　　（三） 免疫组织化学染色结果的判定

　　1、对照的设立

　　设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。主要是针对*抗体对照，常用的对照有阳性对照、阴性对照。

　　（1）阳性对照是用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果。证明整个染色程序符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照就更加重要。

　　（2）阴性对照是用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，另外空白、替代、吸收和抑制试验均为阴性对照。当阴性对照成立时，才能判定检测结果，主要用于排除假阳性。