孔雀石绿检测试剂盒说明书

孔雀石绿检测试剂盒说明书

使用之前要读说明书（中文说名书仅供参考请以英文为准）
适用
本试剂盒适用于水产品中孔雀绿的定量检测。
原理
本试剂盒原理是竞争酶联免疫检测方法，利用萃取剂从样品中提取到孔雀石绿. 在固相载体微孔板中加入标准和处理的样品，然后加入孔雀石绿抗体，反应30分洗孔，然后加入HRP标记的孔雀石绿孵育30分后洗板，洗涤后加入显色剂，结合的酶将无色的显色剂转化为蓝色的产物；加入反应终止液后使颜色由蓝色变为黄色；在450nm波长进行检测，样品中的孔雀石绿浓度与吸收光强度成反比 。
特异性
与孔雀石绿类似物的交叉反应
Compound %
CR
Malachite green 孔雀绿
100%
Leucomalachite 隐色孔雀绿
1%
Crystal Violet 结晶紫
120%
Leucocrystal Violet 隐色结晶紫
2%
检测限
水产品: 0.5 ppb
试剂盒组成
96孔酶标板：1块（8×12条）。 标准品贮备液（Standard）: 1瓶（0.4ml/瓶），100ppb。
酶标记物：1瓶（25倍, 0.8ml）HRP标记的孔雀石绿结合物
孔雀石绿抗体：1瓶（9ml）
底物显色液：1瓶（16ml）
终止液：1瓶（12ml 、1N HCl）。
结合物稀释液：1瓶（15ml）。
样本稀释缓冲液：2瓶（25ml）
浓缩洗涤液：1瓶（5倍， 100ml/瓶）、酶标板的洗涤。
使用说明书
注意
不要使用过了有效日期的孔雀石绿检测试剂盒，不同批次、不同试剂盒之间的试剂等内容不可混用。不使用被污染和稀释的试剂。使用前将所有的试剂拿到室温（20℃-28℃），但不要超出24小时。孔雀石绿是抗生素应小心对待。终止液为1M的盐酸避免接触皮肤，如果不小心滴到皮肤上要马上用水清洗。洗液是5乘的在使用时要稀释。

还需设备
?
去离子水或重蒸水
?
100ml或更大的量筒
?
样品提取和采集用的玻璃器皿
?
甲醇
?
25、50、100 和250μL 单道或多道移液器
?
计时器
?
旋涡混合器
?
洗瓶
?
吸水纸
?
离心机
?
450nm 滤光片的酶标仪
样品制备（肉 1:20 稀释）
1 鱼虾去皮取肉，用匀浆器均质样品，称取5g均质好的样品置于离心管中2 加入10 mL乙腈，振荡器震荡30分
3 4000g离心10分钟
4 轻轻倒出上清, 移入到另一个离心管。
5 用3ml乙腈活化氧化铝柱（1-2滴/秒）。
6 取3ml样品过柱。
7 收集样品于一干净试管中。
8 加入3ml乙腈洗柱并收集与上述步骤7试管中。
9 利用样品稀释液1：10的比例稀释洗脱物（50ul+450ul），待用。
第二种前处理方法： （1:10 稀释）
1. 样品均质后称取4g于离心管中；
2. 加入5ml 0.2MHCL，充分混合5min；室温2000g离心5min
3. 吸取2.5ml上清液，加入5ml二氯甲烷 ，充分振荡2分钟；
4. 室温2000g离心5min，去除上层液体；
5. 转移2.5ml下层液体于另外一只玻璃试管中，50-60℃氮流蒸发；
6. 残留物溶于2ml乙腈，摇匀；
7. 用样品稀释液将混合洗出液稀释10倍（50ul乙腈提取液+450ul样品稀释液）；
8. 移取75ul进行分析。
酶交联物制备
试剂盒提供的酶交联物是25倍的，每次使用前都要稀释。
标准稀释液的制备
乙腈和样品稀释液1:9的比例混合使用
标准的制备
标准品浓度（ppb）
标准品稀释液（ml）
标准品
1
4
40 uL
0.5
1
1.0ml 1ppb的标准液
0.1
1.8
0.2ml 1ppb的标准液
0.05
1
1ml 1ppb的标准液
0.025
0.5
0.5ml 0.05ppb的标准液
0.01
0.8
0.2ml 0.05ppb的标准液
0
1.000
0
操作步骤
1. 使
用前将试剂盒和样品处理物提前从冰箱中拿出来使其达到室温。装有洗液的洗瓶。
2．从铝箔袋中拿出要求数量的微孔条，放入干燥剂并重新封好袋子以免微孔条受潮。
3. 用移液器吸取75 μl 样品处理物到对应的测试孔 ，同时在每个孔中都加入75 μl 抗体溶液。
4. 轻轻震动30秒使其混匀孵育30分。
5. 孵育完成后，将微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板缓冲液清洗微孔。每孔每次至少加入250ul，微震荡洗涤后倒掉，重复三次，总共四次洗板。拍板，去掉残留的洗液。
6. 每个孔加入150 μL 酶标结合物.
7. 轻轻震动30秒使其混匀孵育30分
8. 孵育完成后，将微孔中的溶液倒入水槽中，用配好的洗板缓冲液清洗微孔。每孔每次至少加入250ul，微震荡洗涤后倒掉，重复三次，总共四次洗板。拍板，去掉残留的洗液。
9. 每个孔加入150 μL 底物.孵育30分
10. 每孔加入 100 μL 终止液.
11. 450nm 下读取每个孔的吸光度值（OD）
结果分析
1．
半定量结果的判定，可根据样品的吸光度值与标准的吸光度值来判定，样品的吸光度值低于某个标准的吸光度值，则说明样品的孔雀石绿含量大于此标准的浓度，样品的吸光度值高于某个标准的吸光度值，则说明样品的孔雀石绿含量小于此标准的浓度。
2．
定量结果判定，需要以标准的吸光度值为X轴，标准浓度的对数为Y轴绘制曲线图，将标准浓度吸光度值的点用直线连接，样品的吸光度值也位于这条直线上，根据样品的吸光度值在Y轴上即可找到相应样品的浓度，如果样品的吸光度值大于zui小标准的吸光度值或小于zui大标准的吸光度值，即可说明此样品中孔雀石绿的含量小于0.01ppb或大于1ppb。
3. 当样品的浓度高于1ppb 时要调节稀释倍数来获得zui终的浓度。