ELISA试剂盒检测流行性腹泻病毒抗体的方法说明

ELISA试剂盒检测流行性腹泻病毒抗体的方法说明

一、ELISA试剂盒准备材料
（1） 聚苯乙烯塑料微量组织培养板：4×10孔，。
（2） 包被液（pH值96）：NaHCO3 293g、Na2CO3 195g，蒸馏水加至1 000ml，置4℃保存。
（3） 洗涤液（001mol/L、pH值74PBS）：NaCl 80g、KH2PO402g、Na2HPO4•12 H2O 29g、KCl 02g、Tween20 05ml，加蒸馏水至1000ml。
（4） 保温液：牛血清白蛋白（BSA） 01g、005% PBSTween20 100ml，4℃保存。
（5） 底物溶液（OPDH2O2）
磷酸盐柠檬酸缓冲液（pH值50）：02mol/L Na2HPO4（284g/L）257ml、01mol/L柠檬酸（192g/L）243ml、蒸馏水50ml。
底物溶液：磷酸盐柠檬酸缓冲液100ml、邻苯二胺（OPD）40mg、30%H2O2 015ml，现配现用。
（6） 终止液（2mol/L H2SO4）：浓硫酸222ml、蒸馏水1778ml。
（7） 猪流行性腹泻（PED）抗原：PEDV猪胎肠原代细胞培养物，反复冻融，65℃ 30min灭活。zui后以3 000 r/min离心30min，取上清分装，-20℃保存备用。抗原的蛋白浓度为300μg/ml。
（8） 酶标兔抗猪抗体结合物：按郭春祥方法制备。mol/L比为196，酶结合物效价为1∶10 000。
（9） 被检猪血清：采自疫区猪和病猪。PEDV免疫猪血清及健猪血清分别用于阳性、阴性对照。
二、ELISA试剂盒操作程序
（1） 抗原包被：用包被液将PEDV抗原作1∶5稀释包被反应板，每孔100μl，同时设阴性细胞培养物对照孔，置4℃过夜。
（2） 洗涤：用洗涤液洗涤2次，每次2min，沥干。
（3） 加入被检血清：用保温液将被检血清作1∶100稀释，加入反应板相邻的两个孔中，每孔100μl。同时作阴、阳性标准血清对照，置37℃孵育1h。
（4） 洗涤3次：方法同上。
（5） 加入酶结合物：用保温液将酶结合物作1∶4 000稀释，加入反应孔中，每孔100μl，置37℃孵育1h。
（6） 洗涤3次：方法同上。
（7） 加入底物：每孔100μl，置室温暗盒内显色20min。
（8） 加入终止液：每孔50μl，静置5min。
（9） 测定OD值：用检测仪，于492nm波长，按仪器使用及制定标准要求调节仪器，测定各反应孔的OD值，记录结果。
结果判定凡检测血清P/N值超过14的，均判为阳性。肉眼观察，凡反应孔的颜色比正常细胞对照孔、正常血清对照孔颜色深者为阳性。
三、注意事项
1、各种常用的酶标反应比色计性能不一，测定时需根据各自的仪器确定阈值。
2、在各载体中使用zui多的为聚苯乙烯塑料板。不同厂牌，甚至不同批号的反应板吸附性能往往有很大差异，因此使用前需要加以选择。方法为：在整块板上测定同一标本，求出每一对孔的平均OD值，将此值与该板的总均值相比，其差值需在±10%以内。
3、由于反应板可能存在边缘效应，因此测定标本时至少要取两孔的平均值。
4、如非特异性吸附较强，需考虑采用封闭等方法排除。（1） 封闭：可选用4%～10%牛血清白蛋白、10%小牛血清、10%马血清、01%～25%明胶等。
（2） 去污剂：可阻止非特异吸附，而不影响特异性抗原抗体反应。常用的有005%～05%吐温20、吐温80、01%NP40等。
（3） 高盐浓度缓冲液：如含05mol/L NaCl及005%吐温的磷酸盐缓冲液（pH值80）。
（4） 缩短孵育时间：保温液中加入终浓度4%的聚乙二醇（PEG，MW6 000）可缩短抗原抗体反应的孵育时间（20min以内）。
5、为了增加聚苯乙烯板对某些抗原或抗体的吸附作用，可试用鞣酸处理，牛血清白蛋白处理，改变载体的表面电荷，引入ELISA试剂盒等方法处理反应板。