一、目的和要求

1 学习和掌握用*法及盐溶液法从动物组织提取核酸的原理及操作技术。
2 练习从动物组织提取RNA，并鉴定纯度。

二、实验原理

利用*法可以直接从动物组织中提取RNA，组织匀浆用*处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水层中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后RNA即呈白色絮状沉淀析出。

三、操作步骤

1 称取3克肝组织，剪成小块，置于研钵中，加3-4滴90%的*溶液后研磨，匀浆中加入15mL水，转移至三角烧瓶中，加10mL酚至三角烧瓶中。

2 室温下剧烈振荡45分钟，于3000rpm离心20分钟。

3 用吸管将上层液吸出，并加入1/2体积的氯仿-异戊醇，于低温下振荡20分钟，以除去提取液中的蛋白质，以2000rpm离心10分钟，吸出上层清液，向上清液中加入*粉末，使zui后浓度大约为2%，装入小烧杯后，一边搅拌，一边缓慢加入两倍于上清液体积的95%乙醇以沉淀RNA。

4 于冰浴中放置半小时后，以1000rpm离心5分钟，沉淀再用少量75%乙醇洗涤1-2次，收集沉淀，置于干燥器内干燥，称重。

5 测定A260/A280的值，应大于1.85，若小于1.85，则说明含杂蛋白和DNA高了。

四、试剂的配制

1. NaCl溶液（C.P.）（10%）
2. HCl溶液（6N）
取500mL浓盐酸，用水稀释至1000mL。
3. 乙醇（C.P.）（95%）
4. 苔黑酚试剂（又称地衣酚试剂）
将200mg苔黑酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mg FeCl3·6H2O。
（低温贮藏一周）
5. 二苯胺试剂
将1g二苯胺溶于98mL冰醋酸中，再加入2mL浓硫酸（比重1.84）。
（临用时配制，用前可加几滴乙醛。）

五、操作步骤

1. 取材
在天平上准确称取*3.00g，转移至100mL锥形瓶中。
2. 浓盐浸提
取27mL 10%NaCl溶液，加入到含*的锥形瓶中，搅拌均匀；置于90～100°C水浴中，浸提30～60分钟；冷却。
3. 离心
将锥形瓶中提取液和沉淀全部转移至100mL离心管中，取10mL H2O洗涤锥形瓶，并入离心管中；平衡后以4000转/分钟离心15分钟；将上清液（即RNA提取液）倾入50mL烧杯中，弃去沉淀（菌体残渣）。
4. 沉淀RNA
（1） 冷却：将50mL烧杯置于放有冰块的250mL烧杯中冷却；将温度计插入50mL烧杯中，待溶液冷至10°C以下时，取出温度计。
（2） 调pI：缓慢滴加6NHCl于50mL烧杯中，用玻棒一边轻轻搅拌溶液，一边测量pH值，调节溶液pH至2.0～2.5范围，溶液中白色沉淀逐渐增多，到等电点时沉淀量zui多；继续在冰浴中静止15分钟，使沉淀充分。
（注意：①严格控制pH；②若搅拌过快核酸难以凝聚沉淀。）
5. 离心
将小烧杯中溶液和沉淀移至离心管中，再次平衡、离心（4000转/分钟，15分钟）；弃去上清液，保留RNA沉淀。
6. 洗涤与抽滤
（1） 洗涤：取10mL 95%乙醇加到含RNA沉淀的离心管中，悬浮沉淀，浸泡5分钟。
（2） 抽滤：取大小合适的滤纸，先在数字显示天平上称重；然后放入布氏漏斗中，用少量乙醇湿润滤纸，开启真空泵，使滤纸贴紧漏斗，将沉淀及溶液全部转移至布氏漏斗内；再用15mL 95%的乙醇洗涤离心管，淋洗滤渣。
7. 干燥
用小镊子取出布氏漏斗中的沉淀物和滤纸，转移至表面皿上，置于80°C烘箱内干燥。
8. 称重
取出样品，在室温下冷却数分钟后，将沉淀物及滤纸置于数字显示天平上称重。
9. 颜色反应
（1） 溶解：取50mL水溶解RNA沉淀，同时加2滴NaOH助溶。
颜色反应：取4支洁净、干燥的试管，按下表所示顺序操作

六、结果处理

1. 写出核酸产品的颜色和外形。
2. 计算RNA的粗产品的得率。
3. 由颜色反应的结果，说明产品中含有核酸的情况。

提示：本文动物组织核糖核酸的制备及测定属于动物实验文章，主要介绍核糖核酸、动物组织方面的知识，内容仅供学习交流与参考。

原文地址:/biotech/AnimalExp/2008/k8223947