Oligo在分子生物学研究、临床诊断和药物治疗方面很重要，而对于实验成功与否，选择适当的方法纯化Oligo其实是十分关键的。

一、为什么要纯化？

Oligo有机化学原理是利用结合于固相载体（CPG）上的核甘酸作为3'端*个核甘酸与另一个受保护的去氧核甘酸在催化剂催化下进行缩合反应，随后在氧化脱去5'端保护基DMT后，再与第三个受保护的去氧核甘酸缩合，如此循环达到合成Oligo之目的，缩合合成结束后再利用氨解方法脱去Oligo上之保护基。一般A、C硷基通常採用苯甲醯基保护，G硷基採用异丁醯基保护，亚磷酸採用氰乙基保护，T硷基则不保护。目前固相合成Oligo均在DNA合成仪上进行。前述方法合成之Oligo在氨解脱去保护基后含有大量杂质，纯度极低。其主要杂质为脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨以及氰磷基上脱下的氰乙基等，以致粗产物中Oligo含量仅约15%左右。粗产物中另一杂质则为合成时产生的短链。儘管目前合成方法的每一次缩合反应效率均可达97%以上，但累积效率并不高。以长度为20硷基和50硷基之Oligo为例，97.5%的二十次方约为60%，97.5%的五十次方则只有28%。因此，在粗产物中目标Oligo的含量甚至连10%都不到。前述杂质，尤其是存在于粗产物中的大量短链与盐，不但造成定量不准确，而且有碍下一步的反应，故而Oligo的纯化并不是可有可无的步骤，而是*的工作。

二、选择什么方法纯化Oligo？

近年来，合成Oligo的仪器确实有了很大的进步，但其成就主要集中在成功率提升与试剂消耗降低等方面，从化学合成原理上来看，粗产物中大量短链与盐的存在仍然无法避免。虽然未经纯化的Oligo仍能用于一般PCR反应，但成功率较低。一般来说，除用户特别要求外，代为合成Oligo的公司大多不提供未经纯化之Oligo粗产物，其纯化Oligo的方法约可归纳为下列四类：

1. 脱盐：常用的方法有下述三种

A. 酒精沉淀。粗产物中的氨盐等杂质可溶于酒精，而Oligo在适当盐浓度下不溶于酒精。此一方法脱盐十分简便，但回收产率较低，尤其是较短的Oligo。大多数Oligo合成公司採用此法脱盐。

B. 分子筛。粗产物中的盐可利用Oligo和盐分子量的差别而分离，但此一方法操作複杂，并不理想。

C. RPC柱。反相柱脱盐方法是较理想的脱盐方法，其原理是利用Oligo可专一性地吸附于RPC柱上而达到脱盐目的。

2. OPC柱纯化

OPC柱纯化Oligo的原理是利用保留于5'端的DMT保护基可专一性地吸附于OPC柱上，而短链Oligo由于没有DMT保护基，不易被OPC柱吸附，从而达到脱盐纯化的目的。使用此一方法纯化之Oligo适用于一般PCR或要求较高之PCR反应。但使用此一方法纯化之Oligo常溷有少一到二个硷基之短链，因此并不适于基因合成和DNA定序之用，另外此一方法亦不适于纯化大于40个硷基之Oligo，产率较低。

3. HPLC纯化

HPLC纯化方法和OPC柱纯化方法在原理上颇为接近，也是利用5'端DMT保护基与其他不带保护基的Oligo在管柱上吸附能力不同达成分离纯化的目的，然而由于採用HPLC仪器，其纯化效果优于OPC柱纯化。只要Oligo长度不超过40个硷基，用HPLC纯化的Oligo可用于PCR反应、基因合成和DNA定序。但HPLC方法不适于纯化超过40个硷基之Oligo，在此状况下，虽然目标Oligo带有5'端DMT保护基，其与不带DMT保护基的短链在管柱上之吸附能力差异不大，因此分辨率降低，纯化之Oligo常含有缺少几个硷基的短链。此外，本法对G硷基较多之Oligo也不适用。若採用本法纯化已脱去DMT保护基之Oligo，由于其留置时间仅反映其表面疏水性，不易用以判断Oligo之长短。

4. PAGE纯化

聚丙烯醯氨凝胶电泳（PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是利用电场作用下Oligo泳动速率差异分离纯化样品。由于同时利用静电作用与分子筛效应，并可採取提高分辨率的变性手段，PAGE方法具有*之分辨率，长度仅相差0.2%（即500个硷基中的1个硷基）的DNA分子即可分辨。从凝胶中回收的DNA纯度很高，可适用于要求zui高的实验。PAGE纯化方法是纯化效果*的方法，使用此一方法纯化的Oligo可用于任何分子生物学实验，包括PCR反应、基因合成和DNA定序等。PAGE纯化对于Oligo长度几乎没有限制，即使长达上百个硷基之Oligo也能清楚分辨几个硷基的差异。

虽然PAGE纯化之效果*，但一般很少採用此一方法纯化。其主要原因为此一方法非常费时、费人工，并有毒害，因此十分昂贵。一般採用此法纯化一股Oligo，除基本费用外，仍需加收800至1200元纯化费，以往许多实验室只在进行少数要求较高实验，如基因合成和DNA定序时採用此一方法。但在需要大量高品质Oligo进行实验时，採用此法显然成本过高。生工公司为协助研究单位能以有限的经费完成更高水准的实验，经与国外合作厂商反覆协调，终于争取到约为市面行情1/3之PAGE纯化价格，希望能让研究单位有更多的机会採用此一效果*的纯化方法。生工公司国外合作厂商目前推出之PAGE纯化方桉结合PAGE与RPC柱纯化，先用PAGE纯化去除短链Oligo，再用RPC柱纯化，效果优于其他公司採用之单一PAGE纯化。

原文地址:/biotech/exp/TechArticle/2011/f819561566.html