200．苏州华宇净化工作台在柑橘类果汁中柠檬苦素的含量及其性质研究中的应用实践经验

1 材料与方法          

1.1 主要仪器与材料

SW-CJ-IF 净化工作台：苏州市华宇净化设备有限公司；电热恒温培养箱：湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司；高压灭菌锅：上海医用核子仪器有限公司；JA1003N 分析天平：上海精密科学仪器有限公司；Model680 全自动酶标分析仪：BIO-RAD 公司；CO2 培养箱：SANYO 公司；SW-CJ-IF 净化工作台：苏州市华宇净化设备有限公司；96 孔细胞培养板：海门市天龙实验器。柠檬苦素：由本实验室按照文献[3]制备；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）As1.140：购于中国科学院微生物研究所；细胞株：人胃癌细胞SGC7901，购于上海细胞生物研究所；二甲亚砜：购于AMRESCO 公司。噻唑蓝（MTT）：AMRESCO0793 产品；RPMI1640 培养液：Hyclone 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 果汁中柠檬苦素含量的测定参考文献[3]进行。

1.2.2 柠檬苦素的抗氧化活性

采用猪油自由基体系中猪油过氧化值（POV）表示。在新鲜猪油中按不同添加量添加柠檬苦素（0.1、0.2、0.4、0.8 g/kg）及BHT（0.2 g/kg）,置于70 ℃恒温烘箱中，测定猪油过氧化值（POV）的变化情况[4]。

1.2.3 柠檬苦素的抑菌活性

牛津杯琼脂扩散法，参考文献[5]进行。取处于不同生长时期的枯草芽孢杆菌涂布平板，放置牛津杯，培养24 h 后测量抑菌圈直径大小。柠檬苦素浓度为0.5 g/L，以溶解柠檬苦素的二氯甲烷溶液为空白对照。

1.2.4 柠檬苦素的抗肿瘤活性

通过细胞生长抑制试验（MTT 法）测定。

柠檬苦素溶液的制备：柠檬苦素溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配成10 g/L 储存于0 ℃备用。临用前用培养液配成100 mg/L，4 倍递减稀释。细胞株培养：人胃癌细胞SGC7901 接种在含10 %胎牛血清的RPMI1640 培养液中，置于CO2 培养箱内，37 ℃，5 % CO2 及饱和湿度条件下培养。细胞生长抑制效应的测定：选对数生长期细胞，用0.25 %的胰蛋白酶消化，0.01 mol/L PBS pH7.4 洗2 次，以108 个/L~1011 个/L 的浓度接种于96 孔板中，每孔150 μL。培养24 h 后试验组依次加入新配制的含不同浓度柠檬苦素的培养基20 μL，终浓度为4、20、100 g/L，每个浓度3 个复孔，同时用含DMSO 的*培养基作对照。每天取一培养板加入20 μL MTT（终浓度0.25 g/L），37℃继续培养4 h 后小心吸去培养液，每孔加入150 μLDMSO，振荡器振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择570 nm 波长在自动酶标分析仪上测各孔的光吸收值。存活率/%=（试验组测定的平均A 值/对照组测定的平均A 值）×100