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大鼠谷氨酸脱羧酶自身抗体(GAD-Ab)ELISA试剂盒的基本原理
就是将抗原抗体固定到特定的载体上进行反应,并通过酶催化底物发生化学变化将抗原抗体反应通过颜色的形式显现出来。
(1)将抗原抗体反应固相化:即试验中的包被环节,使抗原或抗体吸附于固相载体表面。其机制可能是聚苯乙烯表面间的疏水基团可以无选择性地吸附蛋白分子。此物理性吸附不破坏蛋白分子结构,保持其生物学特性和免疫学活性;
(2)封闭:固相吸附蛋白是非特异性的,在包被目的免疫蛋白后,未吸附蛋白的固相表面仍然有吸附其它蛋白的能力,为了保障抗原抗体反应的特异性,因此,包被剩余的固相表面应该用抗原抗体反应无关蛋白封闭。一般认为牛血清白蛋白是zui为理想的封闭剂,也可用脱脂奶粉、明胶、牛血清替代。
(3)抗原抗体反应:抗原或抗体在适当的介质下可进行特异的抗原抗体反应。 (4)酶反应:酶可以通过共价键与抗原或抗体连接形成结合物,当抗原抗体反应的时候,被检测靶目标中也结合了酶分子。
(5)ELISA试剂盒底物反应:结合在抗原抗体中的酶分子,可以促使底物发生颜色反应,检测人员可以裸眼观察,可以通过颜色来判定是否有免疫反应的存在,通过颜色的深浅判断标本中相应抗原或抗体的含量,也可借用酶标仪在适当的波长读取吸光度值。
操作注意事项:
● 试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。
● 实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。
● 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
● 使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器。
● 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
● 底物A应挥发,避免长时间打开盖子。底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。避免用手接触,有毒。实验完成后应立即读取OD值。
● 加入试剂的顺序应*,以保证所有反应板孔温育的时间一样。
● 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
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