肿瘤条件培养基制备：

1．取C3H小鼠的S-180实体肉瘤组织。

2．*消化，Dulbecco改良Eagle氏培养液15ml（含10％小牛血清），接种到T-75 Falcon产培养瓶中培养。

3．在细胞生长接近*汇合时，收集培养液制成条件培养基；再用含10％小牛血清的新培养液后，也每隔两天收集一次，可获得多量条件培养基。

4．4000转/分离心后，再通过0.22μm微孔滤膜滤过，－20℃冻存备用（临用前融解）。

初代培养：

1．取材：取新鲜牛肾上腺数个，先用Hanks液洗除血污。

2．剥除被膜，分离出皮质，切成1立方毫米小块，加0.5％胶原酶室温中消化1小时，每隔10分钟用吸管吹打悬液令消化充分。

3．通过不锈钢纱网滤过，网眼要求只允许能通过小于110微米长的毛细血管小段。

4．650rpm，4℃，离心7分钟后，弃掉上清胶原酶。

5．沉淀物用培养液重悬并离心，再重悬，再离心，共两次。

6．末次沉淀物仍用含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle氏培养液重悬后，稍吹打。

7．接种于铺有明胶底层的培养皿中，37℃培养，在培养头1～3小时中，毛细血管小段和内皮细胞zui先帖附于底物上，而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮。

8．趁此时，吸除培养液，再加入肿瘤条件培养液，每两天换液一次。毛细血管小段一般成自1～4个内皮细胞，以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛，能持续2～5天。

毛细血管内皮细胞分离培养：

1．初代培养2～3天后，镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛，在培养皿背面，用不脱色笔划圈圈起。

2．镜下检查，如圈内残有非内皮细胞时，可用显微细针在倒置显微镜下挑除。此操作用细胞解剖器或用手操作均可，宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行，但时间不宜过长（15～20分钟），圈内非内皮细胞可用无菌胶刮除。

3．用培养液漂洗两次，以去除漂浮细胞。

4．剩余内皮细胞岛如小（5～20个细胞）而少时，生长增值变得缓慢或不*不生长，此时需加入3T3等饲细胞，饲细胞接种量为4000细胞/cm2。

5．当内皮细胞充满所有饲细胞空间后，用*消化、离心、加入肿瘤条件培养基。

6．接种入明胶底物皿中继续培养（饲细胞死亡淘汰），细胞增殖生长汇合后，按1：5传代。