NK细胞的制备方法，即通过联合细胞因子和饲养细胞的刺激作用，提高NK细胞的增殖速度和纯度。本发明的主要特点是：NCR3LG1和m?IL-15同时转染到K562细胞，m?IL-15可以调节NK细胞的活化和增殖，而NCR3LG1作为NK细胞表面主要的活化受体之一NKp30的配体，可以有效的刺激NK细胞活化，且两者有协同作用。本发明提供出一种联合饲养细胞和游离因子共同培养制备NK细胞的方法。

1.NK 细胞的制备：悬浮NK 于接种培养液中，细胞浓度调至106/ml。

2.培养基接种NK 细胞

　1）于4℃用300×g 离心饲养细胞12min。

　2）被离心的饲养细胞悬浮于饲养培养液中，细胞浓度调至2×106/ml。

　3）用强度5000radγ射线照射饲养细胞，于4℃用300×g 离心饲养细胞12min，将离心细胞再悬浮于饲养细胞培养液中，饲养细胞浓度调至2×106/ml。

　4）在6 块96 孔培养板的各孔中加100μl 上述饲养细胞悬液（总量用60ml 饲养细胞悬液，含1．2×108 个饲养细胞）。

　5）将96 孔板置37℃孵箱预温，直到加入NK 细胞。

　6）将NK 细胞悬浮于接种培养基液中，并于预温的96 孔板中加入100μlNK 细胞，使成为10 细胞/孔、5 细胞/孔和2．5 细胞/孔的三种类型板，而且每种类型重复二块板。

　7）将培养板置5％CO2 孵箱中37℃培养。

3.NK 细胞的再刺激（接种后2－3 天，主要依赖于饲养细胞）

　1）从每孔中轻轻移弃100μl 上清液。

　2）每孔中加入含有经照射的饲养细胞（2×106 细胞/ml）的NK 克隆培养液100。此培养液的制备方法如下：

　（1）融化饲养细胞，移至50ml 试管中。

　（2）轻轻地加入培养液30ml，混匀后用5000radγ射线照射饲养细胞。

　（3）用300×g 离心饲养细胞12min，并计数饲养细胞数量。

　（4）按细胞计数结果，将饲养细胞悬浮于NK 克隆培养液中，调至细胞浓度为2×106/ml。

4.换液（6－8 天）从每孔中轻轻移弃100μl 上清液，并加入新鲜NK 克隆培养液100μl。

5.检测NK 细胞的生长状况（9－10 天）如检查有细胞生长，按第8 天的操作换液。

6.分离克隆（11－15 天）

　1）当培养基液颜色变黄时，证明细胞已生长，在96 孔板上将生长的NK 按1 孔分为2 孔，2 孔分为4 孔，4 孔分为8 孔的方式分离克隆培养。

　2）在96 孔板上扩增克隆，并重复第7 天的操作。