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GE Whatman沃特曼氧化铝膜在细胞培养中的应用
2017-8-14 阅读(2283)
Anopore氧化铝膜是GE医疗集团生命科学部Whatman膜产品家族中zui特殊的商业化无机膜，它诞生于上世纪 80 年代末。Anopore *孔隙结构既是各种实验室的理想过滤介质（如图 1），还在细胞培养、药物测试、纳米技术等领域广泛应用。Anopore 的孔密度*，现有 200nm、100nm 和 20nm 三种标准孔径，每个孔之间无横向交叉，自身蛋白吸附率极低，荧光背底非常小，也是扫描电子显微镜（SEM）理想射线稳定衬底。因为 Anopore 不含细胞毒素，刚性表面支持细胞的附着和迅速生长，湿润时呈透明状，在光学显微镜下极易观察，既适合荧光和免疫荧光染色技术，又适合电子显微镜原位成像，它兼容现有的 DNA 提取技术，为细胞培养及其分析提供了的便利。
除了常规细胞培养的应用外，Whatman 氧化铝膜（Anopore）还可用于一些比较特殊的应用，分别是：抗生素敏感性实验（AST）、快速药物敏感性测试（DST）和模拟环境样品的组织培养嵌入法（Tissue Culture Insert）。
图 1 Anopore 膜电子显微镜照片
药物敏感性试验通常用于了解病原微生物对各种抗生素的敏感或耐受程度来指导临床用药。致病微生物在 Anopore 氧化铝膜上比其他方式培养生长不易受到限制，有效缩短了培养时间。瑞士 Wageningen 大学 C. J. Ingham 等[1]利用 0.2μm 孔径的 Anopore 氧化铝膜成功实施细菌抗生素敏感性试验。首先将灭菌的 Anopore 放在内含抗生素的琼脂板上，接下来在 Anopore 上接种待测细菌或真菌，置于 CO2培养箱中于 37oC 培养 40min 或数小时，然后
用荧光染料 Fun-1 利用 Anopore 毛细作用对细胞染色，zui后直接用显微镜观察。研究发现，白色念球菌在 Anopore 表面可在 60min 内检测到生长，毛癣菌则在 6h 后检测到生长，检测MIC 值都与 E 试验法相当而检测时间更短，图 2 是 Anopore 上致病微生物成像照片。
图2 （A）荧光染色大肠杆菌 （B）志贺氏菌在Anopore膜上的SEM形貌 （C）荧光染色热带念球菌 （D）伸长型志贺氏菌萌芽管形貌
Anopore还可以缩短总的药物敏感性测试时间，因为致病微生物可在氧化铝膜（Anopore）上直接实施培养、杀死、染色和成像等步骤。C. J. Ingham等[2]运用0.2μm孔径的 Anopore培养接种高传染性的结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis），其中在Anopore上加入常规培养基（LJ）和75%甘油供细菌生长，这种方法zui大程度缩短了测试时间（<3天），将感染性废弃物降至zui小（<2000个菌株形成单元），同时在Anopore膜上做荧光染色和扫描电镜分析也极为方便（如图3）。
图3 结核杆菌在Anopore 表面生长的电子显微镜照片
未来微生物多样性的研究将成为热点，但绝大多数细菌在标准培养方法中无法培养，比如标准实验室法培养出的土壤细菌不到1%。2002年以来，科学家们采用稀释培养基、增加接种次数、模拟自然环境等来解决上述问题，特别是模拟自然环境法已从培养海水中难以培养的微生物发展到培养土壤细菌中来，基于组织培养嵌入（TCI）的土壤基底膜系统法（SSMS）是目前zui有效的培养土壤细菌的方法之一。
澳大利亚New South Wales大学Belinda C Ferrari等[3]运用20nm孔径的Anopre膜作为TCI多孔板，先在Anopore孔内填充环境土壤细浆料形成组织培养嵌入（TCI），接着把接种物转移到聚碳酸酯膜（PC膜）上，再将PC膜盖在反转的（TCI）上，构成了土壤基底膜系统（SSMS，如图4），Anopore还能起到隔离和传输培养液的作用。研究发现，在培养接种土壤细菌经过7-10天的孕育期后，即可观察到土壤菌落（如图5），通过高灵敏度酶法可提取目标土壤细菌DNA。此外，Anopore组织培养嵌入法还成功应用于牛角膜细胞的培养，即用牛角膜血清、DMEM、抗生素等嵌入Anopore膜形成TCI培养基，培养的牛角膜细胞可做内乳酸盐-H+的传输机制研究等[4]。
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| 图4 土壤基底膜系统（SSMS） | 图5 PC膜土壤菌落的荧光显微照片 |
参考文献：
[1] Ingham C., Wever P., Schneeberger P. 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases Nice, France, April 1-4 2006
[2] C. J. Ingham, A. B. Ayad, K. Nolsen, B. MulderRapid drug susceptibility testing of mycobacteria by cultureon a highly porous ceramic support, INT J TUBERC LUNG DIS, 2008, 12(6):645–650
[3] Belinda C Ferrari, Tristrom Winsley, Michael Gillings, Svend Binnerup. C*ting previously uncultured soil bacteria using a soil substrate membrane system. Nature Protocols, 3(8): 1261-1269
[4] Tracy T. Nguyen, Joseph A. Bonanno. Bicarbonate, NBCe1, NHE, and Carbonic Anhydrase Activity Enhance Lactate-H Transport in Bovine Corneal Endothelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2011, 52(11):8086-8093
