小鼠颗粒酶A（Gzms-A；GZMA）酶联免疫分析(ELISA)
试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中颗粒酶A（Gzms-A；GZMA）的含量。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠颗粒酶A（Gzms-A；GZMA）水平。用纯化的小鼠颗粒酶A（Gzms-A；GZMA）捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入小鼠颗粒酶A（Gzms-A；GZMA），再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠颗粒酶A（Gzms-A；GZMA）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠颗粒酶A（Gzms-A；GZMA）含量。
试剂盒组成：
试剂盒组成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
说明书 | 1份 | 1份 | |
封板膜 | 2片 | 2片 | |
密封袋 | 1个 | 1个 | |
酶标包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
标准品 | 0.3ml×6管 | 0.3ml×6管 | 2-8℃保存 |
酶标试剂 | 5 ml×1瓶 | 10 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
样品稀释液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
显色剂A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
显色剂B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
终止液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
20×浓缩洗涤液 | 15ml×1瓶 | 25ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
注：标准品浓度依次为：120、60、30、15、7.5、0 pg/mL.
样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；。
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
注意事项：
1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2． 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4． 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔*孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请zui后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6． 底物请避光保存。
7． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8． 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9． 本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，
在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD
值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释
倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值
代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释
倍数，即为样品的实际浓度。
（此图仅供参考）
试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。
2.批内变异系数与批间变异系数应分别小于10%和15% 。
检测范围：
3.75 pg/mL - 120 pg/mL
灵敏度：
zui低检测浓度小于0.1 pg/mL
保存条件及有效期：
1.试剂盒保存： 2-8℃。
2．有效期： 6个月
基质效应
基质是指样品中目标分析物以外的部分，由于基质成分会对分析过程有显著干扰，影响分析结果的准确性。业内把这些影响统称为基质效应（Matrix Effects）。这是免疫检测方法开发和使用中需要避开的大坑。
Jennifer Rufer事件就是一个典型的基质效应造成假阳性的案例。该hCG试剂盒用的抗体是鼠源的，业界观点认为部分人群血液含有抗鼠抗体（HAMA），它们对鼠源的捕获抗体和检测抗体都有高亲和力，会造成基质效应，导致了假阳性。
如何评估基质效应
基质效应的原因错综复杂，但不用担心，有两种简单的方法可以用来评估基质效应。
1. 线性稀释：
一般来讲，抗原和捕获/检测抗体之间的结合作用很强，样品浓度被稀释并不影响它们的结合，而造成基质效应的非特异结合的力要弱很多，如果不断稀释样品，非特异结合造成的干扰会逐步减少，测量值也更接近真实值。没有基质效应时，无论如何稀释，测量值都和真实值吻合。而有基质效应时，稀释会造成非特异性结合比例的减少，测量值也相应地产生很大改变：
基质效应与线性稀释关系原理
前文提到，基质效应导致的结果有假阴性和假阳性两种，在线性稀释时就可以辨别出来。下图是两组实测的ELISA产品线性稀释的对比结果，不同品牌的ELISA 试剂盒表现差距非常大：
两种类型的基质效应的线性稀释结果比较（左图为两种BDCA-3试剂盒，右图为两种TFPI试剂盒）
图中的纵坐标代表的是回收率。定义用原液直接检测的值为100%，不同稀释比下的测量值先乘上稀释比换算出浓度，再除以原液直接检测的值，比值的百分数，就是回收率。
左图的黄色线，和右图的红色线，曲线平直，回收率稳定在90-110%，很好地控制了基质效应的干扰。左图的紫色线，回收率随线性稀释严重偏离100%，说明存在显著的基质效应；而回收率升高的趋势，说明稀释前的真实浓度被压低，对应基质效应是假阴性。右图的绿色线也严重偏离100%，但回收率随稀释降低，于左图紫色线正好相反，属于明显的假阳性基质效应。
2. 掺入/回收率实验（Spike/Recovery Assay）
基质效应还可以通过分析物的掺入/回收率实验发现，将低、中和高浓度的分析物掺入到已测定过浓度的样本中，掺入前后实测到的浓度增加部分与掺入浓度之比就是回收率，回收率以百分比的形式呈现。回收率介于80-120%，才符合标准。
基质效应
基质是指样品中目标分析物以外的部分，由于基质成分会对分析过程有显著干扰，影响分析结果的准确性。业内把这些影响统称为基质效应（Matrix Effects）。这是免疫检测方法开发和使用中需要避开的大坑。
Jennifer Rufer事件就是一个典型的基质效应造成假阳性的案例。该hCG试剂盒用的抗体是鼠源的，业界观点认为部分人群血液含有抗鼠抗体（HAMA），它们对鼠源的捕获抗体和检测抗体都有高亲和力，会造成基质效应，导致了假阳性。
如何评估基质效应
基质效应的原因错综复杂，但不用担心，有两种简单的方法可以用来评估基质效应。
1. 线性稀释：
一般来讲，抗原和捕获/检测抗体之间的结合作用很强，样品浓度被稀释并不影响它们的结合，而造成基质效应的非特异结合的力要弱很多，如果不断稀释样品，非特异结合造成的干扰会逐步减少，测量值也更接近真实值。没有基质效应时，无论如何稀释，测量值都和真实值吻合。而有基质效应时，稀释会造成非特异性结合比例的减少，测量值也相应地产生很大改变：
基质效应与线性稀释关系原理
前文提到，基质效应导致的结果有假阴性和假阳性两种，在线性稀释时就可以辨别出来。下图是两组实测的ELISA产品线性稀释的对比结果，不同品牌的ELISA 试剂盒表现差距非常大：
两种类型的基质效应的线性稀释结果比较（左图为两种BDCA-3试剂盒，右图为两种TFPI试剂盒）
图中的纵坐标代表的是回收率。定义用原液直接检测的值为100%，不同稀释比下的测量值先乘上稀释比换算出浓度，再除以原液直接检测的值，比值的百分数，就是回收率。
左图的黄色线，和右图的红色线，曲线平直，回收率稳定在90-110%，很好地控制了基质效应的干扰。左图的紫色线，回收率随线性稀释严重偏离100%，说明存在显著的基质效应；而回收率升高的趋势，说明稀释前的真实浓度被压低，对应基质效应是假阴性。右图的绿色线也严重偏离100%，但回收率随稀释降低，于左图紫色线正好相反，属于明显的假阳性基质效应。
2. 掺入/回收率实验（Spike/Recovery Assay）
基质效应还可以通过分析物的掺入/回收率实验发现，将低、中和高浓度的分析物掺入到已测定过浓度的样本中，掺入前后实测到的浓度增加部分与掺入浓度之比就是回收率，回收率以百分比的形式呈现。回收率介于80-120%，才符合标准。
基质效应
基质是指样品中目标分析物以外的部分，由于基质成分会对分析过程有显著干扰，影响分析结果的准确性。业内把这些影响统称为基质效应（Matrix Effects）。这是免疫检测方法开发和使用中需要避开的大坑。
Jennifer Rufer事件就是一个典型的基质效应造成假阳性的案例。该hCG试剂盒用的抗体是鼠源的，业界观点认为部分人群血液含有抗鼠抗体（HAMA），它们对鼠源的捕获抗体和检测抗体都有高亲和力，会造成基质效应，导致了假阳性。
如何评估基质效应
基质效应的原因错综复杂，但不用担心，有两种简单的方法可以用来评估基质效应。
1. 线性稀释：
一般来讲，抗原和捕获/检测抗体之间的结合作用很强，样品浓度被稀释并不影响它们的结合，而造成基质效应的非特异结合的力要弱很多，如果不断稀释样品，非特异结合造成的干扰会逐步减少，测量值也更接近真实值。没有基质效应时，无论如何稀释，测量值都和真实值吻合。而有基质效应时，稀释会造成非特异性结合比例的减少，测量值也相应地产生很大改变：
基质效应与线性稀释关系原理
前文提到，基质效应导致的结果有假阴性和假阳性两种，在线性稀释时就可以辨别出来。下图是两组实测的ELISA产品线性稀释的对比结果，不同品牌的ELISA 试剂盒表现差距非常大：
两种类型的基质效应的线性稀释结果比较（左图为两种BDCA-3试剂盒，右图为两种TFPI试剂盒）
图中的纵坐标代表的是回收率。定义用原液直接检测的值为100%，不同稀释比下的测量值先乘上稀释比换算出浓度，再除以原液直接检测的值，比值的百分数，就是回收率。
左图的黄色线，和右图的红色线，曲线平直，回收率稳定在90-110%，很好地控制了基质效应的干扰。左图的紫色线，回收率随线性稀释严重偏离100%，说明存在显著的基质效应；而回收率升高的趋势，说明稀释前的真实浓度被压低，对应基质效应是假阴性。右图的绿色线也严重偏离100%，但回收率随稀释降低，于左图紫色线正好相反，属于明显的假阳性基质效应。
2. 掺入/回收率实验（Spike/Recovery Assay）
基质效应还可以通过分析物的掺入/回收率实验发现，将低、中和高浓度的分析物掺入到已测定过浓度的样本中，掺入前后实测到的浓度增加部分与掺入浓度之比就是回收率，回收率以百分比的形式呈现。回收率介于80-120%，才符合标准。
基质效应
基质是指样品中目标分析物以外的部分，由于基质成分会对分析过程有显著干扰，影响分析结果的准确性。业内把这些影响统称为基质效应（Matrix Effects）。这是免疫检测方法开发和使用中需要避开的大坑。
Jennifer Rufer事件就是一个典型的基质效应造成假阳性的案例。该hCG试剂盒用的抗体是鼠源的，业界观点认为部分人群血液含有抗鼠抗体（HAMA），它们对鼠源的捕获抗体和检测抗体都有高亲和力，会造成基质效应，导致了假阳性。
如何评估基质效应
基质效应的原因错综复杂，但不用担心，有两种简单的方法可以用来评估基质效应。
1. 线性稀释：
一般来讲，抗原和捕获/检测抗体之间的结合作用很强，样品浓度被稀释并不影响它们的结合，而造成基质效应的非特异结合的力要弱很多，如果不断稀释样品，非特异结合造成的干扰会逐步减少，测量值也更接近真实值。没有基质效应时，无论如何稀释，测量值都和真实值吻合。而有基质效应时，稀释会造成非特异性结合比例的减少，测量值也相应地产生很大改变：
基质效应与线性稀释关系原理
前文提到，基质效应导致的结果有假阴性和假阳性两种，在线性稀释时就可以辨别出来。下图是两组实测的ELISA产品线性稀释的对比结果，不同品牌的ELISA 试剂盒表现差距非常大：
两种类型的基质效应的线性稀释结果比较（左图为两种BDCA-3试剂盒，右图为两种TFPI试剂盒）
图中的纵坐标代表的是回收率。定义用原液直接检测的值为100%，不同稀释比下的测量值先乘上稀释比换算出浓度，再除以原液直接检测的值，比值的百分数，就是回收率。
左图的黄色线，和右图的红色线，曲线平直，回收率稳定在90-110%，很好地控制了基质效应的干扰。左图的紫色线，回收率随线性稀释严重偏离100%，说明存在显著的基质效应；而回收率升高的趋势，说明稀释前的真实浓度被压低，对应基质效应是假阴性。右图的绿色线也严重偏离100%，但回收率随稀释降低，于左图紫色线正好相反，属于明显的假阳性基质效应。
2. 掺入/回收率实验（Spike/Recovery Assay）
基质效应还可以通过分析物的掺入/回收率实验发现，将低、中和高浓度的分析物掺入到已测定过浓度的样本中，掺入前后实测到的浓度增加部分与掺入浓度之比就是回收率，回收率以百分比的形式呈现。回收率介于80-120%，才符合标准。
基质效应
基质是指样品中目标分析物以外的部分，由于基质成分会对分析过程有显著干扰，影响分析结果的准确性。业内把这些影响统称为基质效应（Matrix Effects）。这是免疫检测方法开发和使用中需要避开的大坑。
Jennifer Rufer事件就是一个典型的基质效应造成假阳性的案例。该hCG试剂盒用的抗体是鼠源的，业界观点认为部分人群血液含有抗鼠抗体（HAMA），它们对鼠源的捕获抗体和检测抗体都有高亲和力，会造成基质效应，导致了假阳性。
如何评估基质效应
基质效应的原因错综复杂，但不用担心，有两种简单的方法可以用来评估基质效应。
1. 线性稀释：
一般来讲，抗原和捕获/检测抗体之间的结合作用很强，样品浓度被稀释并不影响它们的结合，而造成基质效应的非特异结合的力要弱很多，如果不断稀释样品，非特异结合造成的干扰会逐步减少，测量值也更接近真实值。没有基质效应时，无论如何稀释，测量值都和真实值吻合。而有基质效应时，稀释会造成非特异性结合比例的减少，测量值也相应地产生很大改变：
基质效应与线性稀释关系原理
前文提到，基质效应导致的结果有假阴性和假阳性两种，在线性稀释时就可以辨别出来。下图是两组实测的ELISA产品线性稀释的对比结果，不同品牌的ELISA 试剂盒表现差距非常大：
两种类型的基质效应的线性稀释结果比较（左图为两种BDCA-3试剂盒，右图为两种TFPI试剂盒）
图中的纵坐标代表的是回收率。定义用原液直接检测的值为100%，不同稀释比下的测量值先乘上稀释比换算出浓度，再除以原液直接检测的值，比值的百分数，就是回收率。
左图的黄色线，和右图的红色线，曲线平直，回收率稳定在90-110%，很好地控制了基质效应的干扰。左图的紫色线，回收率随线性稀释严重偏离100%，说明存在显著的基质效应；而回收率升高的趋势，说明稀释前的真实浓度被压低，对应基质效应是假阴性。右图的绿色线也严重偏离100%，但回收率随稀释降低，于左图紫色线正好相反，属于明显的假阳性基质效应。
2. 掺入/回收率实验（Spike/Recovery Assay）
基质效应还可以通过分析物的掺入/回收率实验发现，将低、中和高浓度的分析物掺入到已测定过浓度的样本中，掺入前后实测到的浓度增加部分与掺入浓度之比就是回收率，回收率以百分比的形式呈现。回收率介于80-120%，才符合标准。
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