人循环免疫复合物(CIC)ELISA 试剂盒

包装规格：48T/96T

检测方法：酶联免疫

检测标本：血清、血浆、细胞培养液等

本试剂盒仅供科研使用!

　合成/代谢elisa试剂盒在实验前：
　　
　　在使用前，将所有试剂和样品室温。再次离心样品解冻后测定前。据建议，所有样品和标准来测定一式两份。
　　
　　1。准备好所有试剂，工作标准和样品在前面的章节中。
　　
　　2。请确定井数的使用，并把任何剩余的井和入袋干燥剂，密封保鲜袋，将未使用的井在4°C的含量布局表
　　
　　。每孔加入100μl的标准和样品。封面用胶粘带提供。孵育2小时，在37℃下一盘布局记录标准和样品检测。
　　
　　4。每孔中取出的液体，不洗。
　　
　　5。向每孔中加入100μl*抗体（1倍）。盖上一个新的胶粘带。孵育1小时，在37℃下（*抗体（1X）可能会出现混浊。预热至室温，轻轻混匀，直到出现均匀解决方案。）
　　
　　6。吸液的各孔和洗涤，共洗涤三次重复该过程两次。洗净，每孔填充洗涤缓冲液（200μL）使用喷瓶，多道移液器，歧管器，或autowasher，和，静置2分钟，*清除液体的每一步是*的良好的性能。zui后一次洗涤后，清除任何剩余洗涤缓冲液的吸ordecanting。倒置板和涂抹对干净的纸巾。
　　
　　7。向每孔中加入100μl的HRP-抗*蛋白（1×）。量的微量滴定板，用一个新的粘接剂条。温育1小时，在37℃下
　　
　　8。重复的愿望/洗涤过​​程中，在步骤6的5倍。
　　
　　9。将90μlTMB底物添加到每个孔中。孵育15-30分钟，在37℃下避光
　　
　　10。一站式解决方案，每孔加入底物，轻轻晃动酶标板，以确保充分混合。
　　
　　11。在5分钟内，设置至450nm，使用酶标仪测定各孔的光密度。如果波长校正，设置为540nm或570nm处。在540nm或570nm波长在450nm处的读数减去读数。该减法校正板的光学缺陷。在450nm处未经修正读数直接，可能会比较高，不太准确。

人循环免疫复合物(CIC)ELISA 试剂盒 实验原理

酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)原理

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

由于酶的催化频率很高，故可*地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度

类型及步骤

ELISA的主要常用类型及步骤

1. 间接法测抗体

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(二抗)以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：

1)将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。

2)加稀释的样本，保温反应。样本中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，样本中的其他成份在洗涤过程中被洗去。

3)加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与样本中受检抗体的量正相关。

4)加底物显色。

2. 双抗体夹心法测抗原

双抗体夹心法是检测抗原zui常用的方法，操作步骤如下：

1)将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

2)加受检样本，保温反应。样本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。

3)加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。*洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与样本中受检抗原的量相关。

4)加底物显色。

3. 双抗原夹心法测抗体

反应原理和模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体

4.竞争法测抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，zui后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

ELISA Q&A

人循环免疫复合物(CIC)ELISA 试剂盒 如何选择合适的阳性对照?

阳性对照的基本组成应该尽量与检测样本的组成*，一般阳性对照多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，加入一定量的待检物质。比如，以人血清为标本的测定，阳性对照多用确定的病人血清或者以复钙人血浆为原料加入一定量标准品。

如何选择合适的阴性对照?

阴性对照的基本组成也应该尽量与检测样本的组成*，先行检测确定其中不含待检物质。比如，检测人血清标本时，阴性对照应该选择正常人血清;检测免疫动物血清中抗体效价时，阴性对照应该选择该动物的免疫前血清。

如何选择*化的包被条件?

1.包被抗原的选择

包被抗原可分为天然蛋白、重组蛋白和小分子抗原三大类。天然蛋白需经纯化才能用直接吸附法包被，对于含杂质较多的抗原可以采用间接捕获法包被(先用能够与目的抗原反应的物质如抗体直接吸附在酶标板上，再通过特异性反应使抗原固相化)。经纯化的重组蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有机化合物，由于分子量太小，往往难于直接吸附在酶标板上，一般都先使其与无关蛋白质如BSA等偶联，偶联物吸附于固相载体上。

2.包被液的选择

一般常用的是pH9.6的碳酸盐缓冲液，如果包被的抗原在碱性条件下不稳定的话，也可以使用pH7.2的磷酸盐缓冲液。

3.包被温度的选择

通常是4-8度条件下过夜或者37度保温2小时，我们强烈建议4-8度条件下包被，有利于蛋白活性的保持。

4.包被浓度的选择

包被的zui适浓度随固相载体和包被物的性质变化，一般蛋白质的包被浓度为1-5ug/ml，要明确针对特定包被抗原的zui适包被浓度需要通过实验来确定。

包板后需要封闭吗?应该选择什么样的封闭体系?

封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤*，不经封闭也可得到满意的结果。而在间接法测定中，封闭一般是*的。

常用的封闭剂有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明胶、5%的脱脂奶粉，AbMART*使用5%脱脂奶粉，价廉而且封闭能力强，不过5%脱脂奶粉只适合短期内使用，不宜*保存，所以试剂盒中较少使用。

人循环免疫复合物(CIC)ELISA 试剂盒  如何正确使用酶结合物?

1.酶结合物的稀释液

在稀释液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如1%BSA或5%脱脂奶粉)，通过竞争抑制酶结合物在固相载体上的非特异性吸附。一般还加入能够抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20(0.05%的浓度较为适宜)。

2.正确稀释酶结合物

酶结合物的合适工作浓度需要通过预实验来确定，浓度过高易导致本底偏高，浓度过低则会导致阳性信号的减弱。

酶结合物在使用前稀释，稀释后的酶结合物不宜*保存，因为低浓度的酶结合物极易失活。

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