戊二醛二步法)

1) 原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

2)标记步骤：

(1) 称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过一夜。

(2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。

(3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。

(4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。)

(5) 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。

(6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。

(7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

(8) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。