人胎儿纤连蛋白（fFN）ELISA试剂盒操作步骤

1、待测样品孔中每孔加入待测样品100μl，每种样品设3个平行孔;设两个阴性对照孔，每孔加未处理组的细胞裂解液100μl;另设一个空白对照孔，加入纯细胞裂解液100μl。

2、酶标板置4℃，包被过夜。

3、洗板：吸干孔内反应液，用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后，即甩去)，之后将洗涤液注满板孔，浸泡1-2分钟，间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。

4、阴性对照孔每孔加入PBS 50μl，样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的兔抗人AIF抗体工作液50μl。

5、酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。

6、洗板，同(4)。

7、每孔加1:5000稀释的HRP-标记的山羊抗兔抗体工作液 100μl。

8、酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。

9、洗板，同(4)。

10、每孔加TMB显色液 100μl，轻轻混匀10s，置37℃暗处反应15-20min。

11、每孔加100μl 2mol/L H2SO4终止反应。

12、分别测450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2，zui终测得的OD值为两者之差(W1-W2)，以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

13、数据处理：在得出标本(S)和阴性对照(N)的 OD值后，计算S/N值。S/N≥2.1为阳性判定标准。

样本保存

1、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2、血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3、细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4、组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5、保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。