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上海莼试生物技术有限公司
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人脉络膜血管内皮细胞培养操作
2022-12-20 阅读(106)
人脉络膜血管内皮细胞培养操作:
1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并 检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分 变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化。
3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；
1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml yi酶，细胞变圆 脱 落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加 入血 清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻 存管做好标识。
3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）250g用于样品稀释。（WS）
卵黄琼脂培养基基础250g加入卵黄，用于厌氧梭状芽孢杆菌的分离培养
庖肉牛肉粒100g加入庖肉培养基基础(027140)，用于厌氧菌的增菌培养和保存，还用于厌氧梭状芽孢杆菌的检验
庖肉培养基基础250g加入疱肉牛肉粒(027150)，用于厌氧菌的增菌培养和保存，还用于厌氧梭状芽孢杆菌的检验。
麦芽浸膏汤250g用于酸性罐头食品商业无菌检验
锰盐营养琼脂250g用于嗜温和嗜热需氧芽孢杆菌的检测
酸性肉汤250g用于酸性罐头食品商业无菌检验
溴甲酚紫葡萄糖肉汤250g用于低酸性罐头食品商业无菌检验
血平板 (成品培养基)20个/盒用于营养要求较高的细菌的培养及溶血试验
哥伦比亚血平板(成品培养基)20个/盒用于一般病原菌的分离培养和溶血性细菌的鉴别
改良克氏双糖培养基250g用于小肠结肠炎耶尔森氏菌的鉴定
硝酸盐蛋白胨水培养基250g用于鉴别绿脓杆菌分解硝酸盐产气试验
半固体琼脂250g供细菌动力观察、菌种保存，H抗原位相变异试验等。(美国FDA、SN、GB)
3%氯化钠三糖铁琼脂250g用于副溶血性弧菌的生化反应。(GB、SN)
血琼脂培养基基础250g加入脱纤维羊血或兔血，制成血琼脂培养基，用于营养要求较高的细菌的培养及溶血试验
葡萄糖铵培养基100g
尿素琼脂培养基基础250g用于鉴别肠道菌尿素酶试验
缓冲动力-硝酸盐培养基250g供产气荚膜梭菌动力和硝酸盐还原测定用
