豚鼠elisa试剂盒检测中应该注意的问题-技术文章-上海莼试生物技术有限公司

目前酶联免疫法检测用试剂盒种类繁多，有国外进口的，有国内自行研制的，如何在众多的品牌中选择既能满足检测要求又价格低廉的试剂盒是一个问题。本人根据使用这些试剂盒，在实际检测中发现，一般在试剂盒说明书中列出以下指标：检测限；回收率；交叉反应率；标准曲线图谱及数据，标准曲线至少由5个浓度组成；IC50测定值及变形曲线点数目的是比较规范的试剂盒，可以选择。

2、临界值(cut-off)的确定

在实际使用酶联免疫法检测时要首先确定临界值。通过检测结果与临界值的比较，可判定样品为阴性或可疑。对于禁用药物，检测方法的临界值为定量限，即现有的*的仪器检测所能达到的定量限。对于有残留*(MRL)的药物，检测方法的临界值为20份添加MRL浓度的样品重复3次测定的均值减去1．64倍标准差。检测结果如小于临界值为阴性，大于或等于临界值或标准规定为可疑，需要用确证法确证。

3、豚鼠elisa试剂盒检测限的测定可添加MRL和MRL上下各一个浓度。

每个试验室在使用酶联免疫法检测时，应做一下各自试验室的检测限。检测限为20份空白样品测定的均值加3倍标准差。如果经规范操作后所得检测限大于临界值时，说明试剂盒背景干扰大，试剂盒灵敏度不能满足检测要求，应与试剂盒或弃去不用选用另外的试剂盒。

4、酶联免疫检测方法验证

在使用酶联免疫法检测样品时，应对方法进行验证。主要测定以下内容：

（1）标准曲线的测定，标准曲线至少由5个浓度组成，测定次数不少于5次，以确定工作浓度范围和IC50范围。一般临界值为IC50附近，检测灵敏度高。

（2）样品检测限的测定。

（3）样品添加回收实验。对禁用药物可添加定量限和2倍定量限，对于有残留*(MRL)的药物，可添加MRL和MRL上下各一个浓度。

准确度：若回收率大于40％符合相应检测标准的要求。精密度：批内变异系数每批平行样之间的变异系数小于或等于25％，对于禁用药物小于或等于30％。批间变异系数所有样品间变异系数小于或等于30％，对于禁用药物小于或等于40％。

满足以上准确度和精密度要求，说明酶联免疫方法可行，可用来检测药物残留。

5、其他

（1）对于可用于多残留检测的试剂盒，以交叉反应率低的药物做阳性添加测定临界值(cut-off)。

（2）豚鼠elisa试剂盒实际检测样品时要包括以下实验：至少做两条标准曲线，两个阴性对照品，两个添加临界值(cut-off)的阳性对照品，两个平行的待检样品。检测结果出来后通过标准曲线形状(符合检测要求为S形)，IC50与临界值是否相近及阳性样品回收率，样品平行情况可确定检测是否可信。

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