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上海莼试生物技术有限公司
主营产品： ELISA试剂盒,ELISA试剂盒价格，ELISA试剂盒报价 |
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鲍球状病毒PCR试剂盒使用方法
2020-1-20 阅读(302)
鲍球状病毒PCR试剂盒使用方法：
一、样品 DNA 的制备
1. 用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
2. 如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的DNA 释放剂试用装。则按下面步骤操作：
3. 配制溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液（足够 10 个样品）为例：在一干净塑料管中加入 10uL 溶液 A 成分一，20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超纯水，充分混合均匀即可。溶液 A 工作液可室温放置，但在一周内用完，不要放置。一次检测一个样品需要 100uL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足够 10 个样品。如果待测样品数量为其他数字，配制的溶液 A 工作液的体积需要做相应的调整。
4. 在标记好的 N+2 个离心管中，加入 1-5mg 固体样品（半粒芝麻大小）或 5uL 液体样品待测样品。在样品制备阳性对照中加入 5uL 阳性对照，在样品制备阴性对照中加入 5uL 水。
5. 在每个管中加入 100 uL 溶液 A 工作液，确保固体样品被溶液淹埋，如果是液体样品则震荡混匀。
6. 95℃保温 10 分钟。
7. 待冷却到常温后加入 10uL 溶液 B 并混匀得 DNA 释放液。每个样品得到的 DNA释放液足够进行 50-100 次 PCR。
二、鲍球状病毒PCR试剂盒 设置 PCR 反应（40 uL 体系）
8. 在 N+2 个 PCR 管中加入下列成分，下面以样品数为 1 举例（注意：如果一次使用DNA 释放剂，每个样品设置两个模板用量的 PCR 反应，两个反应的模板使用量差 10 倍，由此确定用量，以后就用效果好的那个模板用量）：
成份
样品（用量1）
样品（用量2）
阳性对照
阴性对照
即用型 PCR Mix 3.0
20 uL
20 uL
20 uL
20 uL
源性 PCR 引物混合液
2 uL
2 uL
2 uL
2 uL
制备的样品
18 uL
2 uL
无
无
样品制备阳性对照
不加
不加
2 uL
不加
样品制备阴性对照
不加
不加
不加
2 uL
超纯水
不加
16 uL
16 uL
16 uL
9. 轻柔混匀后上机，按下面参数进行 PCR。
过程
温度
时间
预变性
94℃
10分钟
PCR 反应
（35 个循环）
94℃
30s
60℃
30s
72℃
30s
延伸
72℃
7分
10. 电泳检测 PCR 产物。预期的 PCR 产物长度为 216bp。阳性对照必须有此条带出
现，阴性对照必须无任何扩增，否则实验无效。对没有扩增产物的样品，需要用通用引物（如真核生物专一 PCR 引物，需自备）测试是否有抑制剂或样品是否浓度达到 PCR 的要求，如果通用引物也扩不出来，需要浓缩并再次纯化 DNA 样品，或者更换 DNA 提取方法，直到通用引物能够扩增出预计大小的片段。
