一、实验试剂
1、碳酸氢盐/碳酸盐包被缓冲液 (100 mM)
2、PBS
3、封闭液
4、洗涤液
5、抗体稀释缓冲液
二、实验步骤
1. 包被抗原
1) 用 PBS 或碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度 20 μg/ml。吸取 50 μl 稀释抗原到 PVC 酶标板上的*排孔，按要求往后进行系列稀释。
2) 酶标板上覆盖封口膜，室温孵育 2 小时，或者 4 °C 过夜。孵育时间需要优化。
3) 倒掉包被液，用 PBS 洗板 3 次，每孔 200 μl。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。
2. 封闭
1) 用含 5% 脱脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 缓冲液封闭酶标板上剩余的蛋白结合位点，每孔加 200 μl。也可用其他封闭剂如 block ACE、BSA（牛血清蛋白）代替。
2) 封口膜覆盖酶标板室温至少孵育 2 小时，或者 4 °C 过夜。
3) PBS 洗板 2 次。
3. 加一抗和二抗进行孵育
1) 每孔加入 100 μl 稀释好的一抗。
2) 封口膜覆盖酶标板室温孵育 2 小时，孵育时间需要进行优化。通常 2 小时孵育即可获得足够强的信号，但如果获得的信号较弱时，可4 °C 孵育过夜获得较强信号。
3) PBS 洗板 4 次。
4) 加标记二抗，每孔 100 μl。稀释到zui合适浓度（参照说明书），使用前用封闭液现配。
5) 封口膜覆盖酶标板室温孵育 1-2 小时。
6) PBS 洗板 4 次。
4. 检测
1) 用多通道吸液器向每孔加入 100 μl（或 50 μl）底物。
2) 显示出足够深的颜色后，加终止液每孔 100 μl（如有必要）。
3) 酶标仪读取吸光度值（光密度）。
