牛皮蝇蛆PCR检测试剂盒运输：低温
保存：-20℃避光

有效期：一年

货期：2-3周

产品用途：公司产品仅供科研研究实验

试剂组成:

特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品。

2. 根据保守序列设计的专一性引物。

3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4. 一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染。

5. 本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。

本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

注意事项:

1、所有步骤均应在超净工作台上进行，超净台紫外照射至少15min。

2、所有试剂应为此实验专用。

3、使用75％乙醇或其他去污剂擦拭工作台，避免表面污染。

4、进入荧光定量PCR 操作实验室后需要佩戴一次性无菌口罩、无菌乳胶手套、实验中尽量避免与同事交谈，防止PCR 模板污染。

5、实验中使用各种规格的离心管，枪头及配制试剂和溶解沉淀用的水，均应焦碳酸二乙酯（DEPC）处理后使用，以去除吸附的RNA酶污染。

6、使用Trizol试剂时，避免接触皮肤或衣服。避免吸入蒸气。

7、qPCR反应需要qPCR级水，试剂和试管。请务必使用正确类型的qPCR光学PCR管和盖子。不可用普通的PCR管。

8、加样前，先布局，规划加样顺序以避免交叉污染。

9、所有实验应均应设置无模板对照，其中包含除DNA或cDNA样品以外的所有反应组分。

10、先配制qPCR反应混合液，减少误差。

11、加样后上机前，务必通过瞬离将反应液离至管底，并消除溶液中的气泡，因为气泡会干扰荧光检测且降低酶活性，从而降低扩增效率。

操作流程：

RNA 提取 → 反转录 → 设计引物 → Q-PCR

一、 总RNA提取

A组织样本：迅速将新鲜的组织切成合适的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用匀浆器匀浆。每30-50mg组织加1ml Trizol。

B全血样品：加入3-5倍体积的红细胞裂解液到血样中，室温孵育10min，室温3500rpm离心6min。弃上清，原每2-3ml全血样品加1mL Trizol。

C细胞样品：悬浮液中生长的细胞，通过离心收集细胞后，每1×105〜106细胞加入1mL Trizol，移液器吹打混匀，直接裂解或-80℃储存一个月。贴壁生长的细胞，有两种处理方法。一种是移除培养基后，将1mL Trizol直接加入直径3.5cm的培养皿中裂解细胞。或是先用将贴壁细胞消化下来并收集后，再加入1mL Trizol进行裂解。（Note：加入Trizol前, PBS充分洗涤细胞去除残余培养基。）

二、直接法

1）加入1ml Trizol试剂，混匀，冰上孵育10min。

2）4℃，12000rpm离心10min，小心转移上清液到不含颗粒的新EP管中。

3）加入200ul氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育5min。

4）4℃，12000rpm离心15min。混合液分三层，包括最下面的氯仿有机相，中间相和上层水相。小心转移上层水相到新的EP管（大约60％体积的Trizol），不要吸取中间相，可留下少量上层液体！（Note：质量比数量更重要！）

5）加入等体积的异丙醇，轻轻地颠倒混匀约10次，室温放置10min。

6）4℃，12000rpm离心10min。弃上清，1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀两次。

7）4℃，12000rpm离心5min，弃上清，室温下风干5-10min（不要太干，过度干燥会导致RNA难溶解！）。将RNA溶于15μl-50μlDEPC水中。

8）立即进行反转录反应，或先-80℃长期保存。

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