医疗污水处理设备实验流程：

1 材料与方法

　　1.1 样品采集

　　本实验样品取自江苏某医药化工园区废水处理厂, 该废水厂主要功能是处理园区各医药化工企业排放的工业废水, 纳入废水厂管网的废水包括抗生素中间体废水及nong药中间体废水等多种医药化工废水.该废水厂日处理量10万t, 收集的废水中含β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类和四环素类等几大类抗生素生产过程中产生的高浓发酵废水、化学合成废水、其他制剂废水及混合废水(清洗水、冷却循环水和生活污水等).废水中含大量残留的抗生素原材料、副反应产物, 还含有机溶剂二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈、四qing呋喃和二氯甲烷等.废水厂主要采用厌氧-缺氧-好氧(A2O)工艺.本实验样品为活性污泥, 具体取自*混合式好氧生物处理池.取样时先在池内前中后三段各取约500 mL泥水混合样品, 以保证样品具有代表性, 现场混合均匀后, 用无菌50 mL离心管分装后冰袋低温冷藏, 当日即进行基因组DNA提取.

　　1.2 基因组DNA提取

　　使用FastDNA® Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, CA, USA)试剂盒根据产品操作手册提取样品基因组DNA.采用1%琼脂凝胶电泳检测DNA样品的质量和完整性.用NanoDropTM 2 000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)和Qubit® 2.0荧光光谱仪(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)检测DNA的产量和纯度.基因组DNA样品用干冰保藏并立即送往上海美吉生物医药科技有限公司进行测序.

医疗污水处理设备实验流程：

1.3 ARGs生物信息学分析

　　采用Illumina HiSeq Xten平台进行PE150双端测序.首先对原始测序数据进行质量控制, 去除碱基数大于40 bp但是其质量分数低于38的序列, 去掉歧义核苷酸超过10个的序列, 去掉与adapter序列有15 bp重叠的序列.采用SOAPdenovo软件组装clean reads.当选择zui高的scaffold N50 value来进行进一步分析时, 选择不同的K-mer值(49、55和59)用于使用于不同的-d1、-M3、-u和-F参数.将得到的scaffold片段在N段打断, 进而得到scaftig片段.仅仅大于500 bp的scaftig片段被保留以作进一步分析.采用默认参数的MetaGeneMark软件从组装好的scaftig片段来预测开放阅读框(ORFs), 采用CD-HIT来获得非冗余基因.采用SOAPaligner软件将保留的clean read与基因库进行比对, 以计算匹配的数目.通过去除含有少于3个mapped reads映射片段的基因类别来获得unigene.用DIAMOND软件将unigene与NCBI-NR数据库进行比对, 设置blastp参数e-value≤1e-5, 并且采用MEGAN软件LCA算法进行注释.采用DIAMOND软件(blastp, evalue ≤ 1e-5)将unigene对应的蛋白序列在KEGG数据库、eggNOG数据库和CAZy数据库中进行比对.利用BLAST软件(blastp, evalue≤1e-5)将unigene在CARD数据库进行比对, 进行ARGs注释.采用Cytoscape软件进行网络分析, 以研究ARGs与微生物分类的关系.

2 结果与讨论

　　2.1 医药化工污水厂中微生物群落结构

　　在该好氧活性污泥样品中, 经过质量控制后, 共得到reads数目109 523 076条, 并由此组装得到55 255个scaftig, 并预测了105 892个unigene.利用DIAMOND软件将unigene在NCBI-NR数据库中进行比对, 后续用MEGAN软件进行注释, 统计样本在门水平(表 1)及属水平(图 1)上的*个丰度zui大的群落组成.